文档介绍：硕士学位论文
(2010 届)

人 C

Construction of human CD160 transgenic cells and
preparation of anti-human CD160 monoclonal antibody

研究生姓名邵毅
指导教师姓名顾宗江张学光
免疫学
专业名称
细胞免疫
研究方向
论文提交日期 2010 年 10 月
人 CD160 转基因细胞株的构建及单克隆抗体的制备中文摘要

中文摘要

糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白 CD160 是一个 27 kDa 糖蛋白,属于免疫球蛋白超
家族,其基因定位于人染色体。CD160 最早发现于具有细胞毒活性的细胞
表面,有一个 IgV 样结构域,由于剪接拼接的不同,CD160 有四种异构体,之前
的研究都是针对于传统的 GPI-CD160 。 CD160 的 mRNA 和蛋白在人
CD56dimCD16+NK 细胞,NKT 细胞,肠上皮内淋巴细胞(IEL)高表达,而在 B
细胞和脊细胞中不表达。组织中,CD160 在脾、小肠、外周血淋巴细胞中表达较
高,而在脑、肝、心、胸腺等表达较低。在 NK 细胞上,CD160 也能广泛的识别
经典和非经典的 MHCⅠ类分子,并在免疫应答中起到正向刺激的作用。同时,
CD160 跨家族结合 HVEM,抑制 CD4+T 细胞的增殖和细胞因子的分泌,并且降低
CD3ζ链的磷酸化,产生新的共抑制信号途径,在免疫应答中起到负向抑制的作用。
由于这一新的共抑制信号途径发现较晚,CD160 在许多疾病中的作用尚未可知。
本研究旨在克隆人 CD160 基因,并建立 CD160 的转基因细胞株,研制抗人 CD160
的单克隆抗体,为进一步的工作奠定物质基础。

第一部分人 CD160 基因的克隆、基因转染细胞株的建立及其生
物学功能的初步研究

目的:克隆人 CD160 编码区基因,构建含有人 CD160 基因的重组载体,获得
稳定表达基因的转基因细胞,并验证其是否具有功能性。
方法:从人外周血 cDNA 文库中扩增出了 CD160 的基因,并克隆入 pMD19-T
载体,另以 VSIG4 基因的 cDNA 为模板扩增跨膜区基因。将 T 载体和跨膜区基因
双酶切后回收的两个基因片段装入 pIRES2-EGFP 载体,转染 L929 细胞。经 G418
筛选出稳定表达 CD160 分子的转基因细胞株,并命名为 L929/CD160TMV。采用流
式细胞仪等分析鉴定 CD160 分子的表达,并分析其和 L929/HVEM 共培养后的结
合情况。
结果:成功克隆出了 CD160 的基因,构建了含人 CD160 基因的重组载体,筛
选并获得稳定表达人 CD160 分子的转基因细胞 L929/CD160TMV。初步检测该转基
因细胞能结合 L929/HVEM 转基因细胞,证明其功能性。
I
中文摘要人 CD160 转基因细胞株的构建及单克隆抗体的制备
结论:成功建立了可稳定表达人 CD160 分子的基因转染细胞,为研制抗人
CD160 单克隆抗体提供了有效的免疫原。

第二部分抗人 CD160 单克隆抗体的研制

目的:研制鼠抗人 CD160 单克隆抗体,为探讨 CD160/HVEM 相互作用对 T
细胞免疫应答的影响提供手段。
方法:以表达人 CD160 分子的基因转染细胞 L929/CD160TMV 为免疫原,常
规免疫 BALB/c 小鼠,利用 B 淋巴细胞杂交瘤技术,将免疫小鼠脾脏和骨髓瘤细
胞株 SP2/0 融合,并以转基因细胞 L929/CD160TMV 和 L929/mock 分别作为阳性和
阴性筛选细胞进行筛选。采用间接免疫荧光标记法流式细胞仪检测、反复筛选和
多次克隆化培养,获得特异性分泌鼠抗人 CD160 分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株;
采用 Ig 亚型快速定性试纸法,Dot-Blot 和位点竞争结合抑制等实验,对获得的杂
交瘤细胞株和单克隆抗体进行鉴定。
结果:成功获得 1 株持续稳定分泌鼠抗 CD160 单克隆抗体的杂交瘤细胞株,
命名为 3E2,经 Ig 亚型快速定性试纸分析显示,其重链为 IgG1 亚类,轻链则为κ
链。Dot-Blot 鉴定分析,3E2 能与 L929/CD160TMV 细胞裂解液反应,而不与 L929,
L929/mock 细胞裂解液反应。竞争结合抑制实验显示,3E2 和商品化抗体识别不同
抗原表位,不产生竞争作用。
结论:成功获得 1 株稳定分泌特异