文档介绍：第三章细胞和细胞器及间质的分离细胞内各种结构的比重、大小不同, 在同一离心场内的沉降速度也不相同, 所以常用不同介质、不同转速、不同时间,通过分级离心,将细胞内各种结构组分(细胞核、核仁、线立体、高尔基复合体、溶酶体、染色体等) 分离出来。主要方法是: 组织匀浆的制备、离心分级分离各组分、分析鉴定三个步骤。一、细胞的分离根据细胞的大小、密度常可分离不同具有不同生物学特征的各种细胞亚群。其原理是处于悬液中的细胞沉降率与细胞的直径成比例,也与细胞密度和分离介质密度之间差异成比例,假设细胞为球形,则其在溶液中在引力场内的沉降速度以下列公式表示 V= 2g(ρc –ρ s)r 29η遵循 Stokes 定律,其中: ρc和ρs 分别是细胞和溶液的密度, η为溶液粘度, r 为细胞半径, g 为重力加速度。根据细胞直径( 大小) 的分离方法: 主要是速度下降。细胞在单位引力下, 通过低密度介质, 或在低离心力作用下, 通过密度梯度沉降。由于细胞大小不同, 沉降速度不同, 细胞越大沉降越快。根据细胞密度分离是等密度分离, 就是细胞在连续密度梯度分离介质中, 在强离心作用下, 细胞最后到达与其自身密度相同的分离介质层面, 并能保持平衡, 在非连续密度梯度中, 分离的细胞主要集中于介乎其自身密度两种密度介质的交界面上,从而达到分离。操作方法: (一)单位重力沉降法: 分离介质主要是牛血清白蛋白, 其分离的细胞活性高、费用也昂贵。现已用蔗糖替代, 仍能取得较好的分离效果。 1 .在固定沉降池上方加入 30ml PBS/BSA ,含有细胞 1× 10 8 于池底。 2 .从池周边加入 50ml PBS 覆盖于样品上,不要使整个界面破坏。 3 .下口接 1 %蔗糖梯度液,稍松下口,缓慢放入 50ml 1% 蔗糖梯度液,约 10ml/min 。 4 .接通梯度混合仪,从下口加入 1200ml 1~2% 蔗糖梯度液,速度为 50ml/min 。 5 .最后加入 500ml % 蔗糖梯度液。 6 .整个沉降系统,于 4℃,静置 4h ,这时细胞按大小先后沉降,未成熟的红细胞在先,成熟的网织红细胞在最后。 7 .用自动收集器每 15ml 收一组分,流速 15ml/min 。 8 .收集的细胞经过 PBS 清洗, 300g × 10min 离心 2 次,以去除蔗糖。 9. Giemsa 染色,确定各期细胞所在组分。(二)等密度梯度离心法: 1. Ficoll-Hypaque 分离细胞: 直接用 Ficoll 作分离介质, 粘度大, 效果不明显, 加入 Hypaque 可降低分离粘度, 提高分离效果。(1 )制备分离液Ⅰ(比重 ) :取 10 份; % Hypaque , 24 份; 9% Ficol l 混匀。(2) 制备分离液Ⅱ( 比重 ):取 10份; 50% Hypaque , 20份; 9%Ficoll 混匀。(3) 制梯度用硅化的 15ml 玻璃管, 底部加入 4ml 分离液Ⅱ, 然后用注射器在其上小心加入 4ml 分离液Ⅰ。不要破坏梯度界面。(4 )加入 2ml 血清样品于梯度顶部,不要破坏梯度界面。(5) 800g × 20min , 25℃,平甩离心。(6 )离心后可见:最上层是血浆和血小板;血浆与分离液Ⅰ界面是淋巴细胞( 90%)和单核细胞; Ⅰ液与Ⅱ液界面是多形核细胞;沉底的是红细胞。 2. Percoll 分离细胞: Percoll 是一种外面包裹着 PVP 的硅胶颗粒,对细胞无吸附作用,产生的渗透压非常小,因此在全部密度范围保持等张。可在较短的离心速度下,短时间达到浮力密度平衡,对细胞无毒性、无副作用,易于从细胞表面洗脱。(1 )分离骨髓细胞: ①配制 100% Percoll :取 20mlPercoll 原液,加 × 10 PBS 、 Ca/Mg 液。用 HCL 调 pH至 ,用 NaCl 或水调渗透压至 295 ~ 310mosmol/L 。②用 PBS 配制: 40% Percoll 、 70% Percoll 、 80% percoll 。③按比重大小,每一浓度取 10ml 通过注射器加入 50ml 离心管三层,两个界面。④将1× 10 8 细胞的 2ml 骨髓细胞悬浮液小心加于梯度顶部。⑤ 3,000g × 30min , 18~ 20℃,平甩离心。⑥用平滑头吸管,小心均匀的吸出所需细胞,在 40% 与 70% 介质界面,主要是幼稚细胞。⑦用 20 倍体积 PBS 洗涤细胞, 300g × 15min 离心,收集细胞。(2 )分离血细胞: ① 5ml 60% Percoll , 5ml 全血, 250g × 10min