文档介绍：谷氨酰***转氨酶南京工业大学 2011 级食品科学汪开银目录第一、介绍第二、分离与纯化第三、理化性质的研究第四、应用前景第一、介绍谷氨酰***转氨酶( Transglutaminase , EC2 .. 13 ,简称 TGase ) 是一种催化酰基转移反应的转移酶。它具有多种催化功能,能催化蛋白质分子内、分子间发生交联、蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰***基的水解反应,从而直接改变蛋白质本身及蛋白质所附着的细胞、组织等的结构和功能特性。因此, TGase 在食品、生物医药、组织工程、纺织和皮革工业中都有着广泛的应用前景。第二、分离与纯化 主要仪器和试剂 J2-MC 微控高速冷冻离心机; ImageMaster VDS 胶成像分析系统;冷冻干燥机。 N-CBZ- Gln-Gly 、 L-谷氨酸γ-单羟肟酸、还原型谷胱甘肽、羟***。香菇、平菇、金针菇、杏鲍菇等。 谷氨酰***转氨酶活测定方法 Grossowicz 比色法测定酶活力, 以Nα-CBZ-Gln- Gly 和羟***为作用底物, 以 L-谷氨酸-γ-单羟肟酸作标准曲线。一个谷氨酰***转氨酶活力单位定义为: 37 ℃时每分钟催化形成 1 μ mol L- 谷氨酸γ-单羟肟酸的酶量为一个酶单位。从标准曲线求出酶活: 酶活力/( U / mL ) = 5 × A525 ×稀释倍数/10 提取经过初步试验,确定食用菌中的谷氨酰***转氨酶是一种胞外酶。从新鲜香菇子实体中提取谷氨酰***转氨酶粗酶的工艺流程为: 分别测定香菇、平菇、金针菇、杏鲍菇的谷氨酰***转氨酶粗提液的谷氨酰***转氨酶酶活性, 结果分别为 、 、 、 U/ mL 。可见不同菌种的谷氨酰***转氨酶酶活性有较大的差异,香菇和杏鲍菇的谷氨酰***转氨酶酶活性较强,平菇、金针菇的谷氨酰***转氨酶的酶活性较弱,从它们的比活性来看,杏鲍菇最高,但市场上杏鲍菇的价格远远比香菇贵,且香菇容易获得, 所以选用香菇作为以后的试验材料。超滤方法采用 WB-3 型的中空纤维膜, 截留分子量为 30 000 u,在加冰冷却的条件下,保持泵出水压为 ,对粗酶滤液进行超滤循环,直到达到相应的浓缩倍数,收集浓缩液。乙醇沉淀取粗提取液 100 mL,按 V(提取液) ∶V(乙醇) =1∶1;V(提取液) ∶V (乙醇) =1∶ ;V(提取液) ∶V(乙醇) =1∶2体积分数比分别加入经预冷至 0 ℃的95 %乙醇,迅速搅拌,将混和液离心( 3 ℃,10 000 r/min ,10 min ),所得沉淀用 mol/L Tris-HCl 缓冲液( )溶解,再次以相同的条件离心,取上清液定容于 100 mL,测定酶活,计算酶活收率。(酶活收率分别为 40 %、 38 . 7 %、 40 . 8 %) ***沉淀法实验方法与乙醇相同。(酶活收率为 %) 饱和硫酸铵沉淀室温下, 加不同量的硫酸铵到 100 mL 经超滤后的提取液(预冷至 0℃)中,形成浓度为 20 %、 40 %、 60 %、 80 %的硫酸铵溶液,保持 6 h 后,离心( 10 000 r/min 、 3℃、 5 min ), 将所得沉淀用 mol/L Tris - HCl 缓冲液( )溶解,再次以相同的条件离心,取上清液定容于 100mL ,测定酶活,计算酶活收率。(在 60% 时酶活最高,达到 % )