文档介绍：博士学位论文沉默Pokemon基因提高鼻咽癌放射敏感性的研究研究背景和目的博士研究生:牛道立指导教师:陈龙华摘要鼻咽癌是常见的恶性肿瘤之一,80%发生在中国。鼻咽痛由于解剖位置特殊,放射治疗是其主要治疗手段。近年来随着诊断技术的发展,放疗技术的不断改进及各种有效治疗手段的应用,疗效进一步提高,但5年生存率仍徘徊在 70一80%左右。放射治疗是鼻咽痛的主要治疗手段,若在放射线杀灭癌细胞同时应用基因治疗提高鼻咽癌细胞的放射敏感性,有可能获得更好的疗效。近年来,随着分子生物学,肿瘤免疫学等领域的进步和发展,相关基因的克隆及表达成功,使肿瘤的基因治疗成为可能,并有望成为继手术、放疗、化疗及免疫治疗后又一重要的治疗手段。众多的基因治疗中,针对***基因的治疗最引人瞩目,但临床疗效并不令人满意。近年来有学者尝试利用放射线来实现对转移基因体内表达的时空调控,能提高基因靶向表达的效率,同时发现基因治疗还可以提高肿瘤对放射线的敏感性,取得了令人鼓舞的效果。 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由摘要双链RNA(double—stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。近几年来RNAi研究取得了突破性进展,被(Science))杂志评为2001 年的十大科学进展之一,并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,所以该技术己被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。RNAi作为一种高效的序列特异性基因剔除技术在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速。原癌基因Pokemon(zbtb7基因),全长 21600bP。Pokemon基因mRNA长4456bp,该基因由2个外显子构成,其中含有一个开放的阅读框,编码含584个氨基酸残基的Pokemon蛋白,。研究表明,Pokemon可能是通过抑制抑癌基因ARF的转录来发挥致痛作用,通过Pokemon f-*ARF I-·MDM2 t--p53‘一肿瘤发生这一致癌模式而发挥促进肿瘤生长的作用。目前发现原癌基因Pokemon在一些人类肿瘤如淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌和膀胱癌等肿瘤中存在高表达。在鼻咽痛细胞,Pokemon 基因也存在高表达。野生型P53作为Pokemon基因的效应基因,当基因组的DNA 受到损害时,参与受损DNA的修复;如果修复失败,野生型P53将会启动细胞程序性死亡过程,诱导细胞凋亡。研究表明:将野生型p53基因导入肿瘤细胞后能够抑制肿瘤细胞的生长,增加肿瘤细胞的凋亡率。Pokemon基因是一种新的似乎控制着细胞突变的整个过程对癌症形成至关重要的痛基因,它是其他癌基因引发癌症所必须的,此前发现的致癌基因都不具备类似功能。腺病毒、慢病毒载体及原核表达和真核表达系统,常用于特定基因的产物表达。在实验和临床治疗中经常使用的的病毒载体有腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体等,其中由于腺病毒载体转染效率高、插入外源基因片段大、CMV启动的宿主范围广、高病毒滴度、易浓缩贮存、介导外源基因短时呈高水平表达以及不整合到感染细胞的基因组中等优点,使得腺病毒载体成为目前基因治疗研究和临床试验中应用最为广泛的病毒载体之一。 H 博士学位论文目前所采用的病毒载体如腺病毒载体,利用高效的基因转移载体系统,可以有效地将基因治疗和放射治疗结合起来,发挥协同效应,是肿瘤基因治疗的重要方向之一。腺病毒是一种双链DNA病毒,正常寄生于人体上呼吸道,一般不会引起人体疾病,也无致瘤性报道。腺病毒的不整合、不致瘤性使其具有较好的安全性。基因治疗时载体基因组上的E1A和E1B基因已被目的基因所取代, 因而在普通细胞内缺乏复制能力;只有在染色体已整合有E1A和E1B的包装细胞(如293细胞)中,复制能力缺陷型的重组腺病毒才能包装成完整的腺病毒颗粒。腺病毒对实体瘤细胞有很高的感染能力,如肝癌、肺癌、鼻咽癌等。因此,本项目通过采用对Pokemon进行基因沉默的RNAi(RNA interference,RNA干扰)技术,将沉默Pokemon基因的siRN***段及野生型p53 基因重组入缺陷型腺病毒中,构建出重组腺病毒后,将感染重组腺病毒的鼻咽 E-2进行放射治疗,分别从mRNA和蛋白质水平进行检测治疗前后 Pokemon、p53、P14ARF基因的表达情况,流式细胞仪分析细胞凋亡情况,分析其是否能提高鼻咽癌对放射治疗的敏感性。方法 -2细胞常规培养于含10%胎牛血清的1640培养液中,培养箱条件: 5%co:、37*(2恒温。按常规条件消化传代。 ***段合成根据NCBI GenBan