文档介绍：LOGO 印迹杂交分子杂交分子杂交分子杂交?分子杂交:在退火条件下,不同来源的 DNA 互补区形成双链,或 DNA 单链和 RNA 单链的互补区形成 DNA-RNA 杂合双链的过程。?分子杂交广泛用于测定基因拷贝数、基因定位、确定生物的遗传进化关系。通常对天然或人工合成的 DNA 或 RNA 片段进行放射性同位素或荧光标记,做成探针,经杂交后,检测放射性同位素或荧光物质的位置,寻找与探针有互补关系的 DNA 或 RNA 。印迹技术印迹技术?印迹技术是指将待测核酸分子结合到一定固相支持物上的方法。?S outhern 印迹:将电泳分离的 DNA 片段转移到一定的固相支持物上的过程。? Northern 印迹:将 RNA 变性及电泳分离后,将其转移到固相支持物上的过程。这是一种将 RNA 从琼脂糖凝胶中转印到***纤维素膜上的方法。?W estern 印迹:将经聚丙烯酰***凝胶电泳分离的蛋白质样品转移至到固相载体上的过程。 S outhern 印迹 S outhern 印迹? Southern 印迹杂交:DNA 片段经电泳分离后,从凝胶中转移到***纤维素滤膜或尼龙膜上,然后与探针杂交。被检对象为 DNA, 探针为 DNA 或 RNA 。 ?其基本原理是:具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下,可按碱基互补的原则形成双链,此杂交过程是高度特异的。 Southern 凝胶转移杂交技术步骤 Southern 凝胶转移杂交技术步骤 DNA 样品的制备、酶切 DNA 样品的电泳分离:琼脂糖凝胶电泳 DNA 的变性:碱变性 转膜(印迹) 杂交(预杂交、杂交、洗膜) (a) (b)(c) (d) (e) 基因组 DNA DNA 限制片段***纤维素滤膜同探针同源杂交的基因 DNA 片段 X光底片?(一)待测核酸样品的制备? 1 、裂解或破碎细胞? 2 、抽取纯化基因组 DNA ? 3 、限制酶消化 DNA 为大小不同的 DNA 片段?(二)待测 DNA 样品的电泳分离? 1 、琼脂糖浓度:分离大片段用低浓度胶,分离小片段用高浓度胶? 2 、凝胶电泳:凝胶具有分子筛效应,大分子 DNA 泳动慢,小分子 DNA 泳动快,大小相同的分子处于同一条带?(三)凝胶中核酸的变性(碱变化) ?凝胶置于 NaOH 溶液中使 DNA 变性断裂为较短的单链 DNA, 中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液?(四) Southern 印迹?指将电泳分离的 DNA 片段转移到一定的固相支持物上的过程 Southern 杂交 Southern 杂交 Southern 杂交 Southern 杂交?(五) Southern 杂交? 1 、预杂交:封闭膜上能与 DNA 结合的位点,预杂交液为不含 DNA 探针的杂交液? 2 、杂交:液相中的 DNA 探针与膜上的待测 DNA 杂交,双链 DNA 探针需加热变性为单链,再杂交? 3 、洗膜:去除游离的放射性探针或非特异结合的 DNA ?(六)杂交结果检测? 1 、放射自显影:适用于放射性核素标记的探针? 2 、比色或化学发光检测:适于非核素标记的探针?主要应用? Southern 印迹杂交是进行基因组 DNA 特定序列定位的通用方法,是研究 DNA 图谱的基本技术,在遗传病诊断、 DNA 图谱分析及 PCR 产物分析等方面有重要价值。 Northern 印迹 Northern 印迹? Northern 印迹杂交:RNA 片段经电泳后,从凝胶中转移到***纤维素滤膜上,然后用探针杂交。 Northern 印迹杂交常用于检测组织或细胞的基因表达水平。?1、基本原理和基本过程与 Southern blot 基本相同?2、变性: RNA 电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持 RNA 处于变性状态, DNA 电泳前和电泳中不变性;不能用碱变性,防止水解。用***氢氧化银、乙二醛或甲醛变性。 ?3、转膜: RNA 转膜前不需变性和中和处理, Southern 印迹时, DNA 转膜前需进行碱变性及中和处理?4、靶核酸为 RNA ?5、探针可用 DNA 或 RNA 片段 Northern 印迹 Northern 印迹?主要应用?检测某一组织或细胞中已知的特异 mRNA 的表达水平。?比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。 W estern 印迹 W estern 印迹?W estern 印迹,也称 Western 免疫印迹( WesternBlot 或 WesternBlotting ),是指将蛋白质样品经聚丙烯酰***凝胶电泳分离,然后转移至到固相载体上,然后用抗体通过免