文档介绍：东亚飞蝗一氧化氮合酶基因的克隆与功能研究重庆大学硕士学位论文学生姓名:夏新指导教师:夏玉先教授专业:生物学学科门类:理学重庆大学生物工程学院二O一一年十月 Cloning and Characterization of the Nitric Oxide Synthase from Locusta Migratoria Manilensis A Thesis Submitted to Chongqing University in Partial Fulfillment of the Requirement for the Degree of Master of Science By Xia Xin Supervisor: Prof. Xia Yuxian Major: Biology College of Bioengineeringof Chongqing University, Chongqing, China 重庆大学硕士学位论文中文摘要 I 摘要一氧化氮合酶在生物体内专一催化L-精氨酸转化为L-瓜氨酸和一氧化氮。NO 作为一种信号分子,具有调节内皮细胞、平滑肌细胞和神经细胞等功能;作为一种效应分子,参与组织损伤修复,在呼吸、消化、循环免疫等全身多系统的生理、病理生理及有关临床疾病中起着重要作用。一氧化氮合酶催化NO合成过程中,以 L-精氨酸和O 2为底物,还需要多种辅助因子与调控因子,包括NADPH、四氢生物喋呤、FAD和FMN、钙调蛋白与Fe-PPIX。虽然有关昆虫一氧化氮合酶基因的研究已经比较多,大量编码一氧化氮合酶的cDNA序列也已被克隆,但是东亚飞蝗作为一种世界性的农业害虫,目前尚无相关研究报道。本研究以东亚飞蝗为研究对象, 采用RT-PCR和RACE方法克隆东亚飞蝗一氧化氮合酶的基因序列,并分析了该基因在不同组织的表达特征。为研究昆虫内源性NO在对付细菌、病毒、肿瘤细胞等病原体方面如何发挥着至关重要的作用,以绿僵菌CQMa102菌株自然接种侵染羽化3天的群居型东亚飞蝗雄虫为研究材料,分析了不同组织、不同侵染时期一氧化氮合酶基因的表达谱,为东亚飞蝗免疫系统的分子水平研究以及昆虫与病原微生物相互作用机理研究奠定基础。从东亚飞蝗的脂肪体中得到长度为3508bp的cDNA 序列。其5’端非翻译区297bp,3’端非翻译区有202bp,编码区为3006bp,共编码1002 个氨基酸。通过半定量RT-PCR方法检测一氧化氮合酶的组织表达特征发现: LmNOS在东亚飞蝗的头、腿、脂肪体、中肠和血细胞中均有表达,并且在脂肪体、头中呈现高表达趋势,其次是血细胞,而在腿及中肠中表达较弱。由东亚飞蝗一氧化氮合酶基因的组织定位可见,一氧化氮合酶基因在昆虫中多个组织不同时间段中发挥作用,作用范围广,作用周期长,因而可以初步推断一氧化氮合酶在昆虫的生长、发育、代谢等过程中发挥着重要的作用。同时,哺乳动物中有研究表明一氧化氮合酶在小鼠的生理过程中扮演着信号分子和效应分子的角色,发生作用的组织一般为代谢、抗病及细胞行为所发生相关组织,与本研究结果吻合;由此我们可以初步推断,在东亚飞蝗中,一氧化氮合酶扮演着与哺乳动物类似的角色。以绿僵菌CQMa102菌株自然接种侵染羽化3天的群居型东亚飞蝗雄虫,研究侵染后不同时期、不同组织LmNOS的表达特征,推断36h至48h可能是昆虫运用其自身先天免疫对抗病原微生物的重要时期。关键词:东亚飞蝗,一氧化氮合酶,绿僵菌,半定量RT-PCR 重庆大学硕士学位论文英文摘要 II ABSTRACT The recent discovery of nitric oxide as a metabolic intermediate has exploded into a swiftly developing area of research. The intense interest and rapid progress have developed primarily because (i) NO synthesis has been found in a variety ofdifferent cell types; (ii) NO controls and influences a number of critical physiological processes; (iii) NO synthesis via the oxidation of L-arginine has been shown to involve unusual oxidative chemistry and has uncovered novel asp