文档介绍：器材与试剂
        干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等
具体步骤
1. 水:
细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.
2. PBS (也可用于其它BSS,如:Hanks,D-Hanks液的配制):
主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗
溶解定容:将药品(NaCl ,KCl ,Na2HPO4·H2O ,KH2PO4 0. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液。。
移入溶液瓶内待消毒:将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
3. 胰蛋白酶溶液:
       胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,、温度为37℃时,胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS,如:D-Hanks液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
称取胰蛋白酶:%,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水()或PBS(D-hanks)液中。搅拌混匀,置于4℃内过夜。
用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器()抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
4. %胰蛋白酶-%EDTA溶液
称取胰蛋白酶粉末(1:250) ,EDTA ,加入PBSA 100ml,,分装,于-20℃保存。
5. 青、链霉素溶液:
所用纯净水(双蒸水)需要15磅高压20分钟灭菌。具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。分装于-20℃保存。使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。
6. RPMI1640:
溶解、调PH值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。。最后定容至1000ml,摇匀。
安装蔡式滤器:安装时先装好支架,按规定放好滤膜,用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
抽滤:配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
分装:将过滤好的培养液分装入小瓶内置于
4℃冰箱内待用。
使用前要