文档介绍：本科学生实验报告学号学院生命科学学院专业、班级实验课程名称细胞生物学实验指导教师及职称王莎莎开课时间2013至2014学年第一学期填报时间2013年10月13日师大学教务处编印实验名称:实验五、宫颈癌HeLa细胞株培养实验时间:星期二上午一、二节课小组合作:是一、实验预习实验目的(一)、细胞培养准备工作(清洗、消毒、灭菌)能独立地进行用于细胞培养的个中器皿的清洗与消毒,掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作,了解化学消毒法的使用方法。(二)、培养基的配制熟练掌握RPMI1640培养基的配制方法。(三)、细胞传代培养熟练掌握细胞传代培养的操作方法; 观察外培细胞在不同时期的形态变化及生长状况。死活细胞的鉴别掌握死活细胞的鉴别原理及方法实验设备及材料(一)细胞培养准备工作(清洗、消毒、灭菌) 仪器:超净工作台、干燥箱、高压锅、过滤器材料:微孔滤膜(直径25mm): 试剂:75%酒精、重铬酸钾、浓硫酸、NaOH、HCl等(二)培养基的配制仪器:超净工作台、高压灭菌锅、多重蒸馏水、器磁力搅拌器、天平、微量加样器材料:细胞培养瓶、量筒、研钵、烧杯、漏斗、滤纸、pH试纸、微孔过滤器()及注射器、各种规格的Tip、离心管试剂:NaOH、酚红、RPMI1640干粉、小牛血清、青霉素、链霉素、NaHCO3、L-谷氨酰胺(三)细胞传代培养仪器:超净工作台、微量加样器(移液枪)、倒置显微镜、光学显微镜、高压灭菌锅、蒸馏水器、超低温冰箱二氧化碳培养箱材料:细胞培养瓶、血球计数板、滴管、培养细胞试剂:台盼蓝(染料)、乙醇(四)死活细胞的鉴别仪器:显微镜、血球计数板材料:结肠腺癌320细胞试剂:%台盼蓝溶液实验原理及实验流程或装置示意图:(一)原理及示意图: 1、细胞培养准备工作(清洗、消毒、灭菌)原理:(1)清洗与消毒是组织培养实验的第一步,是组织培养中工作量最大,也是最基本的步骤。(2)体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌操作的要求程度很高。细胞培养不好与清洗不彻底有很大关系。(3)灭菌手段的选择也十分重要,对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对,即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了→营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。清洗Tip和Tube的清洗流程:胶塞处理塑料制品的清洗消毒和灭菌洗液的配制 2、培养基的配制细胞培养使用的培养基一般是由合成培养基和小牛血清配制而成。合成培养基有商品出售,它是根据细胞生长的需要按一定配方制成的粉状物质。其主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机离子和其他辅助物质。它的酸碱度和渗透压与活体细胞外液相似。合成培养基的配制准备(清洗与灭菌)流程: 3、细胞传代培养(1)当原代培养细胞或细胞系细胞增殖达到一定密度后,则需要在培养,即将培养的洗吧分散后,以适当的比率转移到另一个或几个容器中扩大培养,此过程为传代培养。(2)悬浮型细胞培养常见于淋巴细胞、白血病细胞、骨髓瘤细胞和腹水型恶性细胞等的培养。由于这类细胞或细胞集体可悬浮在液体培养基中,而不附着在固体表面上,因此无论原代培养或传代培养的细胞增殖过程都没有贴附性细胞那种明显可辨的3个变化阶段,其培养的可见效果是细胞数目的增多及溶液中细胞浓度和密度的加大(3)悬浮型细胞传代培养的最大特点是原代细胞不必经过机械分离或消化酶消化处理,传代时只须把培养的悬浮细胞做适度稀释或把培养细胞经简单的离心处理后再加入适量的培养液即可培养。因此,细胞在从原代到传代的转变过程中遭受的机械损伤和化学损伤的可能性较少,损伤程度也较轻,相对而言,传代的成功率较高。每小组先用一个培养瓶配制50ml的生长培养基流程:每人取10ml培养基到自己的细胞培养瓶内然后向细胞培养瓶内接种10ul的结肠腺癌320细胞株培养株原液放入二氧化碳培养箱,旋松瓶盖根据细胞的数量看细胞瓶是否平放或直立放置4、死活细胞的鉴别(1).细胞的存活率是反映细胞群体生活状态的重要指标。多种方法可以鉴别细胞的死活,最常用到的方法是染色排除法。(2).许多酸性物质不容易穿过活细胞的质膜进入胞,却能渗入死的细胞,使其着色,以次来区别死活细胞。流程:制片计数实验方法步骤及注意事项: Ⅰ、细胞培养准备工作(清洗、消毒、灭菌)(一)清洗(1).新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗,再浸泡5%稀盐酸中和玻璃表面的碱性物质和有害物质。(2).使用过的玻璃器皿的清洗 A、立即进入清水,避免干涸难洗; B、用洗涤剂清洗玻璃器皿,自来水清洗数遍,倒置自然干燥; C、浸酸性洗液过夜; D、从洗液捞出自来水冲洗10~15次去除酸性洗液,蒸馏水刷洗10次,倒置烘干; E、包装(牛皮纸或不透水纸); F、高压(15磅20min)或干热(160度2h)灭菌; G、备用(二