文档介绍：生物学大实验(二)实验名称:质粒扩增、提取和鉴定实验实验目的通过对智力扩增、提取和鉴定试验的实验原理介绍和实际操作, 加深对分子生物学基本技术的理解和掌握。实验仪器设备:电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等。实验原理:质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中,通过对细菌、放线菌和真菌的培养来实现对质粒的扩增。经过处理的线状 dna在外界环境恢复正常的时候不能够复性而质粒dna可以复性,从而可以实现质粒 dna和染色体dna的分离。限制性内切酶能特意地结合于一端被称为限制性酶识别系列的 dna系列之内或其附近的特异位点上,并切割 dna。当对提取的质粒 dna进行电泳时,同一质粒 dna其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。实验步骤:一质粒扩增(1)普通lb固体培养基制备:制备lb培养基,倒入灭菌瓶中高压灭菌,待完全冷却后,保存备用。(2)将大肠杆菌接种于 lb培养基中,37℃振荡培养过夜 (200转/分)二质粒dna的提取(碱法),12000rpm离心一分30秒,弃去上清液,以得到较多的细菌沉淀;、将微量离心管开口倒置在卫生纸上,使离心管底部的液体流尽。3 、加入100μl用冰预冷的溶液 i,剧烈振荡,将沉淀彻底悬浮,然后室温放置 5分钟。、加入200μl现配的溶液ii,盖紧管口,轻轻快速颠倒离心管(不要振荡,以避免dna断裂),使混合物混匀,冰浴 5~10分钟。、加入150μl预冷的溶液iii,盖紧管口,温和颠倒混匀,使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液 iii 中,冰浴 5分钟。6 、取上部水相,移入新的离心管,加入 2倍体积预冷的无水乙醇(也可同时加入 1/10倍体积的醋酸钠),震荡混匀,室温放置10分钟沉淀双链 dna,然后4℃,12000rpm离心10min。7、弃去上清液,将离心管倒置于卫生纸上,使离心管底部的液体流尽后,加入预冷的1ml70%乙醇。8、弃去上清液,将离心管倒置于卫生纸上,使液体流尽,置dna干燥5~10分钟。9、吸除上清液,将管口倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。10、将沉淀溶于34υlte缓冲液或灭菌水()中,储于-20℃冰箱中三dna酶切反应1、将洁净干燥并经灭菌的eppendorf管()编号,用微量移液枪分别加入dna(υl)和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2υl,,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可以用微量离心机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键,要防止错加,漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间,以免活性降低。2、混匀反应体系后,将eppendorf管置于适当的支持物上(如插在泡沫塑料板上),37℃水浴锅保温2-3小时,使酶切反应完全。3、(),混匀,以停止反应,置于冰箱之保存备用。四dna的琼脂糖凝胶电泳1、取5×tbe缓冲液100ml加蒸馏水至1000ml,×tbe稀释缓冲液,待用。2、胶液的制备:称取3g琼脂糖置于1000ml锥形瓶中,×tbe稀释缓冲液,加入微波炉里加热至琼脂