文档介绍：山东农业大学
硕士学位论文
鸭圆环病毒核酸探针检测方法的建立及Cap蛋白核定位信号的研
究
姓名:邹金峰
申请学位级别:硕士
专业:预防兽医学
指导教师:姜世金
2011-06-04
山东农业大学硕士学位论文
中文摘要
鸭圆环病毒(Duck circovirus,DuCV)是圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属
(Circovirus)的新成员。DuCV 感染可导致鸭子羽毛凌乱、生长迟缓、体重减轻等症
状。本研究建立了核酸探针检测鸭圆环病毒的方法,并用此方法对鸭圆环病毒的流行
病学进行了调查,同时借助杆状病毒-昆虫细胞表达系统对 DuCV Cap 基因进行表达
并对其核定位信号进行了研究。
以 DuCV 传染性克隆为模板制备了检测 DuCV 的核酸探针,研究表明该探针特
异性强,只能与 DuCV 核酸发生特异性杂交,而与对照的鸭病毒性肝炎Ⅰ型(DHV-1)
病毒、鸭瘟病毒(DPV )的核酸杂交反应为阴性;灵敏度高,最低检出量为 5pg;使用
方便,适合于批量检测。应用该探针对从山东、江苏、四川等地采集的 196 只鸭病
料,共 1025 份脏器的组织 DNA 进行检测,结果个体阳性率为 %,在各脏器中法
氏囊、肝脏、脾脏的 DuCV 检出率较高,检出率分别为 %、%、%。
通过 PCR 方法扩增完整的 Cap 基因,按正确的阅读框架将其克隆入 pFastBac
TMHTB 杆状病毒载体中,将筛选的阳性重组载体 pF-CP,转化至含有杆状病毒穿梭
载体和辅助载体的 DH10Bac 大肠杆菌感受态细胞中,经过蓝白斑筛选和 PCR 鉴定,
获得重组表达载体 rBacmid-CP。在脂质体的介导下转染 Sf9 昆虫细胞,72h 后获得重
组杆状病毒。Westernblot 和间接免疫荧光(IFA)试验结果表明,本研究成功构建了
表达鸭圆环病毒 Cap 蛋白的重组杆状病毒,表达的蛋白与原核表达 Cap 蛋白免疫小
鼠采集的血清具有良好的反应原性。
DuCV FJ0601株Cap蛋白N端存在36个碱性氨基酸(AA),通过软件PROSITE分
析发现此区域存在两个二分裂核定位信号(Bipartite nuclear localization signal),分
别位于Cap蛋白N端的第2~17位AA和第21~36位AA。为进一步研究鸭圆环病毒Cap
蛋白的生物学功能,我们构建了一系列Cap相关的融合表达质粒,对其核定位信号区
进行了相关研究。首先将强型绿色荧光蛋白(EGFP)插入pFastBacTM HTB载体,构
建pF-EGFP重组质粒,然后构建pF-EGFP-CP、pF-EGFP-CP-Δ17N(N端缺失2-17个
AA)和pF-EGFP-CP-Δ36N(N端缺失2-36个AA) 三个重组质粒分别转染Sf9 昆虫细
胞。结果显示pF-EGFP-CP、pF-EGFP-CP-Δ17N蛋白定位在细胞核中,而pF-EGFP-
CP-Δ36N蛋白定位在胞质中,这一结果证实了PROSITE软件预测的DuCV Cap中的核
定位信号为功能性核定位信号。
关键词:鸭圆环病毒;Cap 基因;杆状病毒表达系统;间接免疫荧光;核定位信号
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鸭圆环病毒核酸探针检测方法的建立及 Cap 蛋白核定位信号的研究
Preparation and Application of DuCV Nucleic Acid Probe and
Subcellular Distribution of Cap Capsid Protein
ABSTRACT
Duck circovirus (DuCV) is listed as a tentative member of the Genus circovirus. Ducks
infected by DuCV exhibit disordered feather, retarded growth, reduced body weight. In the
present study, we use the Baculovirus Expression Vector Systems to express and study the
nuclear localization signal of the Cap gene of DuCV
The infectious clone of duck circovirus was labelled with digoxigenin as a DNA Probe.
The hybridization as