文档介绍：哺乳动物细胞表达系统动物基因工程原理特点与优势哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠,提供复杂的N型糖基化和准确的0型糖基化等多种翻译后加工功能,因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。应用领域哺乳动物细胞表达系统已成为多种基因工程药物的生产平台哺乳动物细胞表达系统在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用研究现状部分蛋白在哺乳动物细胞中的表达已从实验室研究迈向生产或中试生产阶段■已有许多重要的蛋白及糖蛋白利用哺乳动物细胞系统表达和大量制备、生产。如人组织型血纤蛋白酶原激活因子、凝血因子Ⅷ、干扰素、乙肝表面抗原、红血球生成激素、人生长激素、人抗凝血素Ⅲ,集落刺激因子等哺乳动物细胞表达系统的表达水平从整个水平上看仍偏低,般处在杂交瘤细胞单克隆抗体蛋白产率的下限,即130μg/10细胞/24小时。其限速步骤可能是在工程细胞中重组蛋白的分泌效率较低、稳定表达细胞系的筛选构建目的基因的表达载体。确定受体细胞■确定筛选方法(抗生素的使用浓度)■转染后48h,传代铺板(1:100),加筛选药物3-4d换液1次,直至存活细胞长出岛状细胞簇,约2周。克隆耐药细胞检测目基因的存在与表达。二、哺乳动物细胞表达系统(-)宿主细胞(二)表达载体的构建三)表达细胞株的基因共圹增和筛选方法(四)可调控的哺乳动物细胞表达系统高等哺乳动物受体细胞■高等哺乳动物细胞的生长特性■高等哺乳动物受体细胞的条件■高等哺乳动物受体细胞的遗传标记■常用的高等哺乳动物受体细胞高等哺乳动物细胞的生长特性正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征:锚地依赖性:细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂血清依赖性:细胞必须具有生长因子才能生长■接触抑制性:细胞与细胞接触后,生长便受到抑制■形态依赖性:细胞称扁平状,并有长纤维网状结构上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中,一般只能存活50代且在培养皿上以平面的形式生长,即单层细胞生长。有时,正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点,继续增殖并无限制分裂,这种状态称为细胞系形成,此时的细胞成为细胞高等哺乳动物受体细胞的条件以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备以下条件■细胞系特征:丧失细胞接触抑制和锚地依赖特征,便于大规模培养遗传稳定性:外源基因多次传代后不至于丢失,易于长期保存合适的标记:便于转化株的筛选和维持。生长快且齐:分裂周期短,生长均一,便于控制安全性能好:不合成分泌致病物质,不致癌。高等哺乳动物受体细胞的遗传标记遗传标记编码产物筛选药物作用机理APH-氨基糖苷磷酸转移酶G418APH灭活G418DHFR二氢叶酸还原酶氨甲喋呤DHFR变体抗氨甲碟呤HPH潮霉素B磷酸转移酶潮霉素BHPH灭活潮霉素胸腺嘧啶核苷激酶氨甲喋呤TK合成TMPGPRT-黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖霉酚酸XGPRT和成转移酶GMPADA腺嘌呤核苷脱氨酶腺嘌呤木***糖苷ADA灭活Xyl-A