文档介绍：华中农业大学
博士学位论文
猪2型圆环病毒核酸疫苗及重组伪狂犬病毒二价基因工程疫苗的
研究
姓名:宋云峰
申请学位级别:博士
专业:预防兽医学
指导教师:陈焕春
20061201
Ⅻ微克微升毫克毫升碱基对千碱基对千道尔顿纳米牛血清白蛋白脱氧核糖核苷三磷酸酶联免疫吸附试验间接免疫荧光小时分钟秒巨细胞病毒辣根过氧化物酶培养基光密度开放读码框聚丙烯酰胺凝胶电泳外周血单核细胞磷酸盐缓冲液猪圆环病毒猪细小病毒伪狂犬病病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒十二烷基磺酸钠四甲基乙二胺四甲基联苯胺半数组织培养物感染量增强型绿色荧光蛋白牛疱疹病毒蚔猪驮不肪疃竞粟橐呙缂稗ψ槲笨袢《二价摹堋下程疫苗的研究’縍緄【
游橼参研究生鲐索云峰,帆如‘年月学位论文作者张京乏、眸,导师娩签名日期:伽闕麓跞签名日期:∥乙一辏簉必日华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书否如需保密,解密时间年月独创性声明学位论文使用授权书日本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究骷叭〉,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料,,并表示了谢意。本入完全了解“”,印学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本;学校有权保存提交论文的印刷版和电子版,并提供目录检索和阅览服务,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存,,:请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间学位论文是否保密
摘要基因在真核细胞中的表达及定位研究痛臵推牵琁獴基因从靥迳锨邢拢雙靥宓腂位、猪先天性震擅、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎等疾病密切相关。自从世纪年代发现可致猪的疾病以来,病毒在世界各国迅速蔓延。目的免疫系统,导致猪的免疫机能下降,造成其它疾病的大暴发,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。我国也于年检测到了该病毒的存在,该病毒在我国猪群的要是依靠疫苗,而由于该病毒在细胞上增殖滴度很低,发展传统的灭活疫苗和弱毒防制上具有重要作用。本研究以编码核衣壳蛋白的基因为研究对象,实现了基因在真核细胞中的表达,并进一步将基因插入核酸疫苗载体蛴蛟诤怂嵋呙绾汀白陨毙浴盌疫苗中融合表达,通过蛋白达基因的重组伪狂犬病毒痝/煌倍怨菇ǖ腜呙缃辛硕及点,得到虻恼婧吮泶镏柿。通过脂质体转染的方法,将置荧光显微镜下观察荧光,可见转染的细胞有绿色荧光表达,且明显分布于核周,转染南赴灿杏ü獗泶铮ü庵饕7植加诤酥埽细胞质中也发现有大量的荧光,转染的细胞则在整个细胞都可见散在荧光。以上结果说明了我们克隆的基因、蛟谡婧讼赴谐晒Ρ泶铮为基因工程疫苗的研究奠定了基础。猪圆环病毒琍不仅可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征,而且也与猪皮炎与肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征前在猪群的感染率非常高,造成猪的生长缓慢,饲料报酬下降,同时侵害猪感染率近乎%,给我国的养猪业也造成了严重的打击。目前对于该病毒的防制主疫苗非常困难,因此用现代基因工程手段构建的第二代新型疫苗,必然在该病毒的构建了基因的核酸疫苗和“自杀性”呙纾煌苯ň哂械鞍鬃5脊δ艿转导增强疫苗的免疫效应;以伪狂犬病毒弱毒株痝/G妆径荆菇吮物试验,以探索一种可用于防制的新型疫苗。通过椒ɡ┰鯬基因和基因,将扩增的基因连入载体克隆测序后,用双酶切将基因切下,连入载体的虰盖形坏悖玫絆虻恼婧吮泶镏柿S、和柿7直鹱H镜紿赴校H笤诘甈猜驮不返斩竞怂嵋呙缂稗εξ笨袢《二价肇闪桃呙绲难芯
细胞上增殖滴度为‘。基因的重组伪狂犬疫苗毒株的构建甈怂嵋呙绲墓菇ā⒚庖咝вρ芯浚约癇基因免疫增强效应研究甈白陨毙浴盌疫苗的构建、免疫效应研究,以及凇白杀性”呙缰械拿庖咴銮啃вρ芯泶颬盖形笨袢《疽呙缰晁//蜃椋胫刈樽和颍玂蚩寺∪胝婧吮泶镌靥.,构建了的核酸疫苗,同时分别将具有蛋白转导功能的蚍直鹂寺〉絆虻纳嫌魏拖掠危苟呷诤媳泶铮菇质粒。将上述质粒以及空载体.∪饷庖/“资螅裁庖次,间隔埽直鹩谑酌夂周和二免后懿裳#苗组产生了特异性抗体,而单独用基因构建的核酸疫苗的免疫原性比较弱,证明稍銮亢怂嵋呙绲拿庖咝Ч渲幸訠在上游效果更好,可作为防制的一种候选疫苗将基因克隆到“自杀性”呙缭靥錺和,构入基因的上游,构建了“自杀性”苗载体。肌肉注射免疫,“资螅酌夂周加强免疫一次,分别于首免后周和懿裳#肊方法检测血清体液抗体水平。从觳饨峁梢钥出,一次免疫后芗纯纱碳ば“资蟛攵訮奶匾煨蕴逡嚎固澹鳥蛋白转导的效果在“自杀性”呙缰械男Ч⒉幻飨浴将基因插入伪狂犬病毒重