文档介绍：第卷第期中国预防兽医学报.. .
年月.
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猪瘟病毒野毒株与疫苗株双重
实时荧光定量检测方法的建立
王伟,符芳,陈欣,李雪松,李海忠,李曦
.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室,黑龙江哈尔滨
哈尔滨师范大学,黑龙汀哈尔滨】
摘要:为建立猪瘟病毒免化弱毒疫苗株与野毒株的快速鉴别检测方法,本研究根据登
录的株与野毒株的基因序列差异,设计对特异性引物,建立了同时检测株与野毒株的双重
实时荧光定量方法。应用该方法对野毒和疫苗株的最低检出量为拷贝;检测牛病毒
性腹泻病毒型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂大病病毒和猪圆环病毒型种病毒均呈阴性;批内、批间
重复试验的变异系数均低于%。应用该方法检测从黑龙江省各地区猪场采集的份样品,结果表明野毒株
的阳性率为.%。该方法可应用于野毒株和株的鉴别检测。
关键词:实时荧光;猪瘟病毒野毒株;株
中图分类号:. 文献标识码: 文章编号:—..
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猪瘟,是由病毒为发热、咳嗽、共济失调、结膜炎以及腹泻、死
引起的一种高度接触性传染病,被世界动物胎、流产等,剖检无指征性病变。属黄病毒
卫生组织列为必须报告动物疫病川。临床表现科、瘟病毒属,为有囊膜的单
收稿日期:——
基金项目:黑龙江省自然基金重点项目—
作者简介:王伟一,女,黑龙江哈尔滨人,硕士研究生,主要从事兽医传染病及病原生物学和分子免疫学
研究.
通信作者::.
第期王伟,
股正链病毒,基因组大小约为.。依据并以该为模板,加入随机引物和—进行
病毒蛋白基因、’非编码区’和聚合酶基反转录。
因序列的差异,可将分为、、
表引物序列
个基因群。系统进化分析结果表明株属于基
因群,能够诱导机体产生针对不同强毒株和各种
基因群的免疫保护作用。流行病学调查显
示,我国野毒株均属于基因群,由于株—:
的广泛使用,即使在实验室检测野毒感染时, 株:
也难以将两者区分开。目前, 已有采用—
和探针方法鉴别野毒株和株的报. 标准品的制备以反转录的为模板,应
道⋯。用表中的特异性引物进行常规扩增,回收目
本实验采用实时荧光技术, 的片段。将经测序产物大小分别为和
根据株与野毒株蛋白基因序列的差异,没计的片段,,获得野毒株和
对特异性引物,建立了同时检测株与野毒株的双株的重组质粒作为标准品。
重实时荧光定量方法,该方法. 熔解曲线的绘制将野毒株和株的标准品
为快速、准确鉴别野毒株和株提供了有效按照~ 倍比稀释作为模板,通过特异性引物
的检测方法。进行实时荧光反应。反应体系
为:、./野毒株
材料和方法上下游引物各、./的疫苗株上下游引
物各、无菌水、。反应条件
. 病毒株及病料石门系强毒株、为:。;℃、℃,个循环。
免化弱毒疫苗株、牛病毒性腹泻病毒型溶解曲线分析温度为℃~℃。采用
. 株、猪繁殖与呼吸综合征病毒—软件进行分析。
株和株、伪狂犬病病毒.