如何理解扩增的原理与过程.doc

文档介绍：1、如何理解扩增的原理和过程? 该技术模拟体内天然 DNA 的复制过程, 其基本原理是在模板、引物、4种 dNTP 和耐热 DNA 聚合酶存在的条件下, 特异扩增位于两段已知序列之间的 DNA 区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板, 如此循环 30次, 介于两个引物之间的新生 DNA 片段理论上达到 230 拷贝(约为 109 个分子)。 PCR 技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。 PCR 由变性-- 退火-- 延伸三个基本反应步骤构成: ①模板 DNA 的变性: 模板 DNA 经加热至 93℃左右一定时间后, 使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备; ②模板 DNA 与引物的退火( 复性) :模板 DNA 经加热变性成单链后,温度降至 55℃左右,引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合; ③引物的延伸: DNA 模板-- 引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下,以 dNTP 为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-- 退火-- 延伸三过程, 就可获得更多的“半保留复制链”, 而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2~4 分钟, 2~3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍(Plateau) 。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。在此同时认识到蛋白质是接受 RNA 的遗传信息而合成的。 2、核酸分子标记有哪些方法,各有何特点? (一)均匀标记: 需要复制一段新的探针分子, 在复制过程中掺入标记的核苷酸, 从而使整个新分子被均匀地标记. 显著特点是探针分子的标记不局限在一个位点上, 因此, 均匀标记可使探针的标记信号扩大, 得到高比活度的探针.(1 )切口平移标记, 新合成的被标记的分子可以代表该待标记 DNA 分子的绝大部分核苷酸序列. (2) 随机引物标记, 扩增出来的 DNA 产物包括从任意某个位点起始的单链 DNA 片段, 产物群体包含了目的 DNA 所有核苷酸序列信息, 多用来标记 DNA 片段. (3) PCR 扩增标记, 尤其适合于探针 DNA 浓度很低的情形. (4) 单链探针, 不存在互补双链, 因此可以消除探针的两条链在杂交过程中形成无效双链的可能性, 从而增加探针与靶序列探针与靶序列之间形成杂合体的稳定性, 提高检测的灵敏度. (二)