文档介绍：基因敲除小鼠技术转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术,该技术从上世纪七八十年代诞生以來,U有近四十年的丿力史,经典技术如DNA原核显微注射、胚胎T细胞显微注射技术一玄以來经久不衰,并逐渐从基础研究实验室转向商业模武,成为-•项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术,该技术从上世纪七八十年代诞生以来,至今已有近四十年的丿力史,经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以來经久不衰,在小鼠模型构建方面日趋完善,并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样,逐渐从基础研究实验室转向商业模式,成为一-项高度标准化的新兴产业,催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此,传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷,如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等,而ZFN和TALEN等新技术的出现,或有可能将这一局面彻底改变。二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代屮后期基于DNA同源重组的原理发展起來的,hi和Smithies在1987年根据同源重组(bination)的原理,首次实现了ES的外源基因的定点整合(targetedintegration),这一技术称为〃基因打靶"(argeting)或〃基因敲除"(geneknockout),利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠(KOMice:knockoutmice);由于这一工作,hi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。同源重组(bination)定义:是指发生在姐妹染色单体(sisterchromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子Z间或分子Z内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程屮,需要针对日的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体,将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组,如图1所示:图1•基因敲除鼠制作同源重组原理示意图三、:argetingvector: ”PoRegioninsertedintogenomeGenomicDNA:RegionremovedfromgenomeModifiedgenomicDNA:构ItKexIcout我体■、il过电转将心ockout戏体 在药物存导入ES细18中 通获得将口胚移植§狀孕母Ifl体内 生产出获合体小81后与野生型小61杂交根据研究项目具体情况和要求把的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA片段都重组到带有标记基因(如neo基因,TK基因等)的载体上,成为重组的Knockout载体。KnockoutES细胞筛选Knockout载体测序验证正确后,将载体线性化,然后电转入ES细胞,通过载体上的正负筛逸基因获得阳性的KnockoutES克隆。选取PCR鉴定打靶载体止确插入的ES基因组DNA用于SouthernBlot鉴定,将SouthernBlot鉴定的KnockoutES扩大培养并液氮保存。KnockoutES细胞囊胚注射得到嵌合体小鼠扩增经鉴定插入或置换片段位置正确的KnockoutES细胞,以囊胚显微注射的方武将一定数量的KnockoutES细胞注