文档介绍：转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术,该技术从上世纪七八十年代诞生以来,已有近四十年的历史,经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰,并逐渐从基础研究实验室转向商业模式,成为一项高度标准化的新兴产业 一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术,该技术从上世纪七八十年代诞生以来,至今已有近四十年的历史,经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰,在小鼠模型构建方面日趋完善,并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样,逐渐从基础研究实验室转向商业模式,成为一项高度标准化的新兴产业,催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。尽管如此,传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷,如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等,而ZFN和TALEN等新技术的出现,或有可能将这一局面彻底改变。二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的,hi和Smithies在1987年根据同源重组(bination)的原理,首次实现了ES的外源基因的定点整合(targetedintegration),这一技术称为"基因打靶"(argeting)或"基因敲除"(geneknockout),利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠(KOMice:knockoutmice);由于这一工作,hi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。同源重组(bination)定义:是指发生在姐妹染色单体(sisterchromatin)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。在基因敲除小鼠制作过程中,需要针对目的基因两端特异性片段设计带有相同片段的重组载体,将重组载体导入到胚胎干细胞后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组,如图1所示:、(如neo基因,TK基因等)的载体上,成为重组的Knockout载体。,将载体线性化,然后电转入ES细胞,通过载体上的正负筛选基因获得阳性的KnockoutES克隆。选取PCR鉴定打靶载体正确插入的ES基因组DNA用于SouthernBlot鉴定,将SouthernBlot鉴定的KnockoutES扩大培养并液氮保存。,以囊胚显微注射的方式将一定数量的KnockoutES细胞注入特定品系小鼠囊胚中,然后将囊胚移植到假孕的小鼠子宫中。待后代小鼠出生后,通过小鼠的毛色中来源于ES细胞毛色的比例判断嵌合程度的高低,以及该小鼠的后代中可能获得生殖系传递能力。,后代小鼠出生后,通过PCR方式检测小鼠是否含有打靶序列。如有,则该小鼠为具备生殖遗传能力的Knockout小鼠(F1代鼠)。,通过后代小鼠毛色或PCR基因型鉴定的方法验证嵌合体小鼠生殖系传递能力。四、基因敲除常见方法一、常规基因敲除鼠(ConventionalKnockout)常规基因敲除是通过基因打靶,把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用NeoCassette替换掉。这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响,而且这个基因没有胚胎致死性。二、条件性基因敲除小鼠(ConditionalKnockout)条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶,把两个loxP位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。该小鼠和表达Cre酶小鼠杂交之前,其目的基因表达完全正常。当和组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后,可以在特定的组织或细胞中敲除该基因,而该基因在其他组织或细胞表达正常。条件性基因敲除鼠适用范围为:(1)该基因有胚胎致死性;(2)用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。三、基因敲入小鼠(Knockin)基因敲入小鼠是通过基因打靶,把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点,使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选,信号通路的研究等。获得嵌合体及之后品系纯化详细