文档介绍：实验五:质粒DNA的双酶切与电泳检测实验目的通过本实验掌握质粒DNA双酶切的原理和操作方法、实验原理●限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。每一种内切酶能识别DNA分子中由4~6个核苷酸组成的特定序列一●寄主控制的限制与修饰现象多种细菌能合成限制性内切酶,这是它们保护自己,降解外来DNA分子的重要手段。细菌细胞内的DNA由于相应序列上的A或C碱基的甲基化而不被限制性内切酶攻击,而外源DNA一旦进入细胞则立即被识别,双股DNA螺旋都被切断。限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具,常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同,分为三类:I型、Ⅱ型和Ⅲ型限制性内切酶按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同,分为三类:I型、Ⅱ型和Ⅲ型特性I型酶Ⅱ型酶ⅢI型酶限制和修饰活性单一多功能的酶单一的成分2种不同的亚基蛋白质结构3种不同的亚基单一的成分2种不同的亚基辅助因子APP、Mg2+、MIg2+APP、Mg2+、寄主特异性位点序|EcoBTGANTGCTECoPI:列旋转对称切割位点距特异性位点至少位于特异性位点距特异性位点序列特异性切割不是是是在DNA克隆中的用途无用十分有用有用I型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链,但是切割的核苷酸顺序没有专一性,是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大,无法用于分析DNA结构或克隆基因这类酶如EcOB、Ec等。Ⅲ型限制性内切酶也有专一的识别顺序,但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对不是特异性的。因此,这种限制性内切酶切割后产生的定长度DNA片段,具有各种单链未端。因此不能应用于基因克隆Ⅱ型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序,并在该顺序内的固定位置上切割双链,是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。识别的专一核苷酸顺序最是4个或6个核苷酸,少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。Ⅱ型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序,即有一个中心对称轴,从这个轴朝二个方向“读”都完全相29-2RecognitionSequencesforSomeTypellRestrictionEndonucleases(5JAAGCTT(3)BamHI(6,)(3'TAGG(5'GC(3(5)ATCGAT[3)GGCGTAGCTA(5)CTGCAG(3)(5”)GAATTO3)TTAAG(5CAGCTG仔EcORV(5)GATATC3'GTCGACTt111(5]NNGTC(3)(5)43'CTGNNNCAG●粘性末端:是交错切割,结果形成两条单链末端,这种末氢端如ECoRI的识别顺序为:G''G表示中心对称轴,从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG,这就是回文顺序。‘表示在双链上交错切割的位置,切割后生成两个DNA片段,各有一个单链末端,两条单链是互补的,其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合●平头末端:Ⅱ型酶切制方式的另一种是在同一位置上切双链,产生平头末端。例如EcoRV的识别位置是GAT'TATAG切割后形成两种片段,片段末端同样可以通过DNA连接酶连接起来