实验三 质粒DNA的酶切鉴定.ppt

文档介绍：分子生物学实验Experiments of molecular biology
授课教师:田生礼
实验三质粒DNA的酶切鉴定
实验三质粒DNA的酶切鉴定
【目的要求】
;
,载体与供体进行酶切;
;
【实验原理】
限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的特定的核苷酸序列,并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶,共有I型、、II型、III型三类, II型限制性内切酶识别含4-8个核苷酸且具有回文对称性质的核酸序列,并在识别序列内或侧旁特异性位点切开DNA双链,产生平齐末端和带单链突出端(粘性末端)的DNA片断,常用于基因克隆的载体切割、外源DNA的制备。在分子克隆中I、III类型限制性内切酶都不常用。
【实验器材】
台式离心机、振荡器,恒温水浴,微量移液器(20uL, 200 uL 1000uL), Enpendorf管。
【实验材料】
限制性内切酶( BamH I和Xho I )及酶切缓冲液、无菌水,质粒DNA溶液。
【实验内容】
:
,电泳鉴定。
3. 酶切体系的建立:
成分
单酶切
双酶切
质粒(T-AD)
10
10
10X缓冲液
2
2
去离子水
7
6
BamH I
1
1
Xho I
---
1
总体积
20ul
20ul
37度水浴1个小时
酶切电泳图
M:DL5,000 DNA Marker;1:质粒DNA;2单酶切质粒DNA(BamH I);3:双酶切质粒DNA(BamH I和Xho I)。
影响限制性内切酶的因素很多,酶反应条件是实验成功的重要因素,其中包括反应的温度、时间与反应的缓冲体系、DNA的纯度和浓度等。
酶切反应体系的组成:DNA量→酶量(最多占总体积的1/10)→总体积,即根据所用DNA的量确定用酶量,再根据用的酶量确定总体积。。酶切时加样顺序一般应为:水+缓冲液+DNA+酶,以保证酶的活性。向管中加入每个组分后都要用手指轻拨管子以利混匀,最后加酶混匀,离心后保温酶切。
限制酶特点:
-8个相连的核苷酸,以6个多见;
限制性内切酶的识别序列
BamH I 5’-G-3’
3’-CCTAGG-5’
Not I 5’-GCGC-3’
3’-GGCG-5’
(palindrome);
;
EcoRI 5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
,也有例外。
Fok I 5’-GGATGNN -3’
3’-CCTAC  NN-5’外侧,产生3’-端突起
5. 识别序列严格,少数有变动,序列中的核苷酸被甲基化后,不能被切割。
限制性内切酶的切割方式
内切酶切割后产生的三种末端
a) 5’突出的粘性末端
如, EcoR I 5’-G  AATTC-3’
3’-CTTAA  G-5’
b) 3’突出的粘性末端
如, Pst I 5’-CTGCA  G-3’
3’-G  ACGTC-5’
c) 平末端
如, Sma I 5’-CCC  GGG-3’
3’-GGG  CCC-5’
同裂酶:能识别相同序列,切割位点可以相同也可以不同,来源不同的酶。
(1)同裂酶(Isoschizomers)
①完全同裂酶:
识别位点和切点完全相同。如Hind Ⅲ和Hsu I。
Hind Ⅲ 5’-AAGCTT-3’
3’-TTCGAA-5’
Hsu I 5’-AAGCTT-3’
3’-TTCGAA-5’
同列裂酶和同尾酶
Xma I 5’-GGG -3’
3’-C-5’
Sma I 5’-CCCGGG-3’
3’-C-5’
识别位点相同,但切点不同。如Xma I 和 Sma I。
②不完全同裂酶:
Asp718I 5’-G -3’
3’-CCATG  G-5’
Kpn I 5’-GGTAC  C-3’
3’-C  CATGG-5’