文档介绍：科研中的 miRNA 研究方法总结 microRNA(miRNA) 是一类长度在 22nt 左右的内源非编码小 RNA ,广泛存在于动物、植物、病毒等多种有机体中。 1993 年, Lee 等人在秀丽新小杆线虫() 中发现了控制着线虫时序性发育的 lin-4 。 2000 年, Reinhart 等发现了另一个具有转录后调节功能的小分子 RNA : let-7 。随后的几年时间里,许多研究人员相继发现了这类 RNA ,并将这些具有时空表达特异性的非编码小分子 RNA 命名为 microRNA(miRNA) 。从长的初级 miRNA(pri-miRNA) 到形成成熟的单链 miRNA 到与靶标 RNA 结合,至少需要四步:首先是由核糖核酸酶Ⅲ Drosha 和 DGCR8 组成的复合物将初始 miRNA 转录本( pri- miRNA )加工成 miRNA 前体( pre-miRNA ) ;接着由转运蛋白 Exportin-5 和 Ran GTP 酶将 miRNA 从细胞核转运到细胞质中;第三步是由另一种核糖核酸酶Ⅲ Drosha 将 miRNA 前体剪切成成熟的 miRNA 双链, miRNA 双链打开,其中一条进入到 RNA 诱导的沉默 RISC 复合体( RISC )中,该复合体还包含 TarRNA 结合蛋白( TRBP ) ;最终 RISC 复合体根据 miRNA 与靶标 RNA 的互补配对,对靶基因进行剪切,或者翻译抑制。图1 miRNA 生物学调控过程(摘自文献 8) miRNA 通过作用于相应靶 mRNA ,参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢、发育、肿瘤转移等多种生物学过程。预测超过 1/3 的人类基因都是保守的 miRNA 靶基因。近些年,随着科学研究的进展,大量的 miRNA 已经被鉴定出来,截至目前发现的人的成熟的 miRNA 有 2578 条, 小鼠的有 1908 条。虽然 miRNA 的数量很多,但大多 miRNA 的功能并不为人所知。因此,准确快速地预测并鉴定 miRNA 的靶基因,对研究 miRNA 的功能具有十分重要的意义。下面本篇文章将着重介绍一下在医学科研领域中如何快速高效的鉴定与人类疾病相关的 miRNA 及其功能研究方法。一、 miRNA 的定量检测成熟 miRNA 的片段小,只有 21bp 左右,变异较大,在不同细胞中的表达差异较大,低表达的 miRNA 为其定量检测带来了很大的困难和挑战。尽管如此,随着科学的进步,越来越多的 miRN A 检测方法被建立起来,极大程度的促进了 miRNA 研究进展。下面介绍下在疾病研究中常用的五大 miRNA 定量检测方法。 Northern blotting: 是较为经典的检测各组织和器官中 RNA 的量和大小及估计其丰度的实验方法。主要实验步骤包括: ①完整的 RNA 的分离; ②根据 RNA 的大小通过琼脂糖凝胶电泳对 RN A 进行分离; ③将 RNA 转移到固相支持物上,在转移过程中,要保持 RNA 在凝胶中的相对分布; ④将 RNA 固定到固体支持物上; ⑤固相 RNA 与探针分子杂交; ⑥除去非特异结合到固相支持物上的探针分子; ⑦对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析。优点:高度灵敏,而且通过结合 RNA marker 可以检测出 miRN