《分子生物学》课件-分子生物第六章.ppt

文档介绍：第六章 分子生物学技术
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内容
1、 核酸提取与鉴定
2、 印迹杂交技术
3、 聚合酶链反应
4、 重组DNA技术
5、 转基因技术与基因打靶
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核酸提取与鉴定
研究对象：基因组DNA、质粒DNA、总RNA、mRNA等
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第一节 核酸提取
总原则：
保证核酸一级结构的完整性
避免杂质污染
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核酸提取的主要步骤：
破碎细胞
提取
纯化

——内容物释放
、纯化
，并去除杂质
 

核酸提取过程
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一、质粒DNA
质粒 (Plasmid)是游离于细菌 (及个别真核细胞)染色体DNA之外、能自主复制的遗传物质
多数是一种闭环DNA，大小为1-300kb，能够转化细菌，是基因载体
提取质粒DNA包括三个基本步骤
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1·培养细菌和扩增质粒
在培养基中加入抑制剂 (例如***霉素)可以抑制细菌的蛋白质合成，从而抑制细胞分裂，而质粒DNA会继续复制，拷贝数可达3000个，这一过程称为质粒扩增
如果要扩增的质粒DNA携带***霉素抗性基因 (CmR)，可以用壮观霉素替代***霉素
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2·收获和裂解细菌
①机械法:超声波、玻璃珠等（易引起DNA断裂）
②化学试剂法:十二烷基硫酸钠 (SDS)等（单用难以充分裂解）
③溶菌酶-化学试剂联合法:先用溶菌酶消化，再用化学试剂处理（最常用）
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3·分离纯化质粒
关键：除去染色体DNA
质粒DNA特性：
①相对较小（%-2%）
②闭环（染色体DNA大量断裂并且呈线性结构）
提取方法：***化铯密度梯度分离法、碱裂解法、煮沸裂解法等
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（1）***化铯密度梯度分离法
EB分子可嵌入相邻碱基对之间，使DNA解旋
开环DNA或线性DNA存在游离末端易于解旋，可结合大量EB，DNA-EB复合物含EB越多，密度越小
闭环质粒DNA没有游离末端，不易解旋，结合少量EB，密度较大
在饱和EB条件下，质粒DNA密度比断裂染色体DNA密度大，经***化铯密度梯度离心，可分离提取质粒DNA
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