文档介绍：单克隆抗体制备实验历程
一、 免疫动物
免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的历程。 一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，凭据预先制定的免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
说明：FCA，弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody，北京康碧泉公司研制的佐剂。上表中第四种免疫要领产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。
PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。
2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，发起注射在左侧腹腔，如果采取右侧腹腔注射，则在免疫历程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。
3、打击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，不然相应的B细胞数量会下降到未打击前的水平。
二、细胞融合 （Cell fusion）
【质料和试剂】
（1）骨髓瘤细胞悬液 选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤疏散骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。
（2）免疫小鼠脾细胞悬液 取3天前增强免疫的小鼠，眼眶放血，疏散血清冻存备用。拉颈正法小鼠，浸泡于75％酒精中3～5min。无菌操纵取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用铰剪剪成3～5个小块，然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml，1000r/min离心5min，弃上清，再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，～2
×108 个脾细胞。
饲养细胞 将小鼠致死、体表消毒和牢固后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，袒露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意制止穿入肠管。右手牢固注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻推拿腹部1分钟，随后吸出注入的培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮，凭据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2×105/ml，备用。
主要试剂的配制
①细胞培养基杂交瘤技能中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种底子培养基，配好后过滤除菌（），分装，4℃生存。
不完全RPMI-1640培养基：
RPMI-1640培养基原液
96ml
100×
1ml
双抗溶液
1ml
%NaHCO3溶液
1-2ml
HEPES溶液
1ml
不完全DMEM培养基：
DMEM
超纯水或四蒸水
980ml
NaHCO3
双抗溶液
10ml
100×
10ml
用1N -，过滤除菌，分装4℃生存。
完全RPMI-1640或DMEM培养基：
不完全RPMI-1640或DMEM培养基
80ml
小牛血清
15-20ml
HT或HAT培养基：
HT培养基
HAT培养基
完全RPMI-1640或DMEM培养基
99ml
98ml
HT贮存液
1ml
1ml
A贮存液
1ml
②氨基喋呤（A）贮存液（100×，4×10-5mol/L）
（Aminopterin MW ），溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH ，再补加超纯水或四蒸水至100ml。过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃生存。
③次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液（100×，H：10-2mol/L，T：×10-3mol/L）
（Hypoxanthine，MW ）（Thymidine，MW ），加超纯水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶（