文档介绍：植物生物学大实验----
自己设计实验材料的石蜡制片和显微测量与分析方法
1 取材
选取经过自己设计实验的对照和处理的材料的根、茎、叶的相同部位。
2 固定和抽气
在测定生理指标的同时,进行固定,固定液为FAA(75℅酒精90ml+冰醋酸5ml+甲醛5ml)。,重复3次,材料的长和宽最大不超过1cm。固定液为材料的20倍左右。将选取的材料分装两试管,加入固定液。固定时间24小时,其间要放入抽真空机中抽气15-30分钟至材料完全沉浸在固定液下面。并用铅笔写好标签。
3 脱水、透明及渗蜡
将材料从固定液中取出后,其具体流程如下:
A:酒精 X:二甲苯
75%A(2h)→85%A(2h)→95%A(2h)→100%A(2h)→100%A(2h)→3/4A+1/4X(2h)→1/2A+1/2X(2-3h、过夜)→1/4A+3/4X(2h)→X(2h)→1/2X+1/2蜡(过夜)→渗蜡1(2h)→渗蜡2(2h)→渗蜡3(2h)
设置浓度梯度是为了防止材料皱缩,但具体浓度梯度和浸泡时间要视材料情况而定,对于幼嫩的材料,梯度要大些,各步浸泡时间可短些,老的硬的梯度则要小些,各步浸泡时间则相应要长些。第二次100%A脱水很关键,一定要确保水脱尽。
4 包埋
将渗蜡后的材料和石蜡一起倒入小纸盒,用加热的镊子迅速把材料按需要的切面和一定的间隔排列整齐并使其竖直,倒入纯蜡进行包埋。稍微凝固后倒置于清水盆中彻底冷却凝固。
5 修块
将包埋好的材料切割成小块,每个小块包含一个材料,并修成梯形,切面在梯形的上部。注意上部矩形对边平行,梯形底部用烧热的蜡将其固定在木块上。
6 切片
将粘有蜡块的小木块至于切片机上,调整切距到适当大小,转动调节器条切片厚度12µm进行切片。注意切片时要一手转动切片机,另一手执毛笔将切下来的片子摊开以形成一长条蜡带。切片过程中,如果蜡带偏向一边,也要及时修正。
7 烫片
滴一滴蛋白胶于干净载玻片中央,用干净的手指涂抹均匀后,滴上清水,将取下的蜡带切成小段置于载玻片上(放上两至三段),然后将载玻片放到展片台上(保持40℃)烫片。待充分烫平后用吸水纸吸去多余的水。
烫片时要注意把握时间,不能烫片过度,但要保证充分烫平。
8烘片
将烫好的片子自然烘干,或45℃烤片箱干燥1~2天。
9脱蜡、染色、脱水、透明
将玻片标本放于100%X(15-30min)→100%X(1-2min)→50%X+50%A(1-2min)→100%A(1-2min)→95%A(1-2min)→85%A(1-2min)→番红(85%A配制)(2-4h)→85%A(3-5s)→95%A(3-5s)→固绿(100%A配制)(30s)→95%A(1-2min)→100%A(1-2min)→100%A(1-2min)→50%X+50%A(1-2min)→100%X(1-2min)→100%X(1-2min)
注意番红染色时间要长些(至少3h以上),随后的两次经过酒精的时间都应很短,以免洗掉染上的番红,固绿的染色时间大约在20-30s,其他各步的时间大约1至2分钟,均要视具体情况而定。
10封片
从二甲苯中取出然好色的片子,用中性树胶进行封片。注意封片用的该玻片要清洁,封片时要注意不要产生气泡。
在显微镜下分别进行4×10倍和10×10倍观察各切片,并进行显微数码摄影,同时用软件测量以下具体参数:维管束大小、导管腔面积、表皮层厚度、导管束束数、茎壁厚度等,重复4次,测量所得到的数据用目镜测微尺进行校正,各组数据进行统计分析。
将生理和形态结构获得的结果进行综合分析,写出论文。
植物制片的一般原理与方法
植物制片的方法及准备
植物制片技术是植物显微技术课的一个重要组成部分,在有关植物形态建成、植物杂交育种、作物病虫害防治、药用植物的培育和鉴别以及林木材性鉴定等多方面的研究和教学工作中,都需要应用显微制片技术,由于各种作物器官的性质差异以及研究目的的不同,就需要不同的制片方法,但因限于学时及篇幅,本书仅根据常用的基本原理及教学中行之有效的方法加以介绍。
第一节植物制片的基本要求与主要制片方法
植物内部结构不能用大而厚的组织块置于显微镜下观察,必须进行制作切片,才能供显微镜下观察应用。
石蜡(或徒手)切片,是将植物切成薄的材料,按下列主要步骤与要求制成永存切片。
:材料的选择与分割
、固定与器皿清洗
(有的不经此步)
(各级酒精)
(例如浸蜡)
(石蜡包埋)
(切片机或徒手切片)
(石蜡)
(脱水)