文档介绍：宏基因组学方法研究明永冰川初步试验计划
起草人：李浩宇
宏基因组学研究方向及意义
研究：环境胁迫对集体遗传变异过程和机理。
发掘：环境应激和应答基因多态性。
探究：多态性基因功效。
试验大致步骤：
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1）避免人源污染，采样器具全部要高温灭菌，采样过程中要戴手套。
2） 样品快速处理保留。有条件最好用液氮冷冻运输，没有条件能够将装有样品容器至于干冰泡沫箱中。带回试验室以后要立即处理，尤其是固体样品，快速用预冷缓冲液 (多为PBS)重悬，离心搜集沉淀。分装成小份，冻存于液氮或‐80 ℃ 冰箱中，避免反复冻融。
3）假如后续用间接法提取总DNA 话，此处需要搜集菌体，采取策略是稀释以后差速离心，通常适适用于水样。
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总DNA 提取根据处理样品方法不一样划分为直接提取法和间接提取法。
直接提取法就是直接对样品进行裂解，释放其中DNA。
间接提取法则是先分离样品中微生物，后对微生物进行裂解。两种方法适用范围不一样，各自全部有优缺点。
直接提取法优缺点：直接提取法多用在提取固体样品(如土壤、污泥、湖泊沉积物等) 总DNA 试验中。其最大优点在于得率高，在一些环境样品总DNA 提取实例中，比间接提取法高数倍至数百倍。造成这种情况最关键原因一是环境样品中存在丰富胞外DNA；二是很多微生物和基质形成复杂结构，间接提取法不易对其进行分离。在样品较珍贵时多采取此法。其缺点一样显著，所得DNA 纯度远不及间接提取法所得，基质中含腐殖质一并被保留下来，使得所得DNA 展现黄褐色甚至黑色。
能够考虑MoBio 和EpicentreDNA提取商业试剂盒(关键用于提取土壤样品)。
间接提取法优缺点：间接提取法则既能够用来提取固相样品总DNA 也能够用来提取液体样品总DNA。在提取液体样品 (如海水、河流等样品)总DNA 时，需要用抽滤方法浓缩。和直接提取法刚好相反，其最大优点在于提取DNA 纯度高，既使在提取固体样品微生物总DNA 时，也能够用缓冲液对搜集菌体进行反复冲洗以去除表面所带杂质。其缺点是DNA 得率低。
土壤DNA 直接提取法：
(1) 从超低温冰箱中取出保留样品 (5 g)；
(2) 于室温融化；
(3) ml CTAB 抽提缓冲液和50 μl 蛋白酶K 贮存液；
(4) 离心管于37oC 225 rpm 水平振荡30 min；
(5) mL20%SDS；
(6) 65oC 水浴2 h，每隔15 min 轻轻颠倒数次；
(7) 室温6,000g 离心10 min，搜集上清液，转移至一个新50 ml 离心管中；
(8) ml ml 20%SDS，轻轻涡旋至混匀；
(9) 浸入液氮中冷冻3 min 后，于沸水中煮沸3 min；
(10) 室温6,000g 离心10 min，搜集上清液，和上次上清液合并；
(11) 反复(8)、(9)、(10)一次；
(12) 将三次提取所获上清液和等体积苯酚：氯仿(1:1 v/v) 混合，摇匀后于4 ℃
12,000g 离心10 min；
(13) 将上层水相转移至一新50 ml 离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，
混匀后于4 ℃ 12,000g 离心10 min；
(14) 再次转移上清至一新离心管中， 倍体积异丙醇于室温沉淀1 h；
(15) 室温12,000g 离心20 min；
(16) 搜集沉淀，用预冷70%乙醇洗涤沉淀；
(17) 向离心管中加入1 ml TE，于4 ℃ 放置过夜，分装保留于‐20 ℃。
试验过程中注意事项及部分技巧：
(1) 整个提取过程吹吸动作要轻柔，避免猛烈震荡(试剂盒提取除外)。
(2) 用到枪头在灭菌之前最好将头部剪掉，避免机械剪切。
(3)酚氯仿抽提时，中间相一定不要吸到，宁可多丢弃部分。
(4) 异丙醇沉淀时不要放在低温， 倍体积室温沉淀足够了。
(5) DNA 溶解时能够放在4℃ 静置过夜，次日离心取上清去除多出杂质。
(6) 水平震荡能够用左右摇摆震荡器。
水样DNA 间接提取法：
(1)抽滤方法浓缩采集到水样。
(2)采取差速离心取得水样中菌体。
(3)取得微生物后进行裂解提取。
此方法还在查证中，具体前期对样品处理方法还在整理中。
比如：用多少水样进行浓缩，差速离心转速选择。
会不会有DNA丢失等等。
Epicentre推出了宏基