文档介绍：《分子生物学》试验汇报

试验一植物基因组DNA提取及其定性、定量分析
【试验目标】
经过本试验学****利用CTAB法从植物组织中提取DNA并经过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。
【试验原理】
CTAB(十六烷基三***溴化铵)是一个阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下( M NaCl)，和蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、***仿抽提方法去除蛋白，最终经乙醇沉淀得到DNA。
琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DN***段常见技术。把DNA样品加入到一块包含电解质多孔支持介质(琼脂糖凝胶)样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。因为糖-磷酸骨架在结构上反复性质，相同数量双链DNA几乎含有等量净电荷，所以，在一定电场强度下，DNA分子迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身大小和构型。DNA分子迁移速度和相对分子质量对数值成反比关系，分子量小DNA分子比分子量大DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也能够分离相对分子质量相同，但构型不一样DNA分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L DNA)，最慢为开环质粒DNA(ocDNA)。
核酸分子(DNA或RNA)因为含有嘌呤环和嘧啶环共轭双键，在260 nm波优点有特异紫外吸收峰，其吸收强度和核酸浓度成正比，这个物理特征为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于dsDNA 50 μg/mL，ssDNA 33 μg/mL和ssRNA 40 μg/mL。能够此来计算核酸样品浓度。紫外分光光度法不仅能确定核酸浓度，还可经过测定260 nm和280 nm紫外线吸收值比值(A260/A280)估量核酸纯度，若DNAA260/，则可能有RNA污染，。
【仪器、材料和试剂】
一、仪器及耗材
离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000 μL
量程各一支)、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、 mL EP管、PE手套和乳胶手套。
二、药品
三羟***氨基甲烷(Tris)、CTAB(十六烷基三***溴化铵)、β-巯基乙醇、***仿、苯酚、乙醇、***化钠(NaCl)、盐酸、液氮、硼酸、乙二***四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、核酸染料。
三、试剂
1. 2×CTAB buffer【1】
70%乙醇【2】
RNaseA (天根)【3】
×TBE缓冲液(工作浓度) 【4】
6×loading buffer【5】
6. 核酸染料(赛百盛)
7. DNA marker DL (Takara)
8. 酚/***仿 (1:1, V/V) 【6】
【试验步骤】
1. 取约100 mL EP管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。
2. mL 2×CTAB提取液（﹪巯基乙醇），混匀，65℃ 水浴30 min，每10 min颠倒混匀一次。
3. 取出离心管， mL酚***仿混合液，混匀。
4. 11,500 rpm室温离心8 min(若没离好可反复一次)。
5. 将上清液(约400 μL) mL离心管中。
6. 加入和上清等体积***仿，混匀，11,500 rpm 离心8 min，取上清(约350 μL)。
7. 加入600 μL无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放置30 min。
8. 4℃，15,800 rpm离心20 min，弃上清。
9. 1 mL 70％乙醇(预冷)洗涤沉淀2次，上下颠倒几次，不能vortex，7,000 g离心3 min，弃上清，风干。
10. 加入30 μL无菌水(含20 μg/mL RNase A)，37℃ 溶解DNA 30 min。
11. 取5 μL DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测：
(1) 制备琼脂糖凝胶
g 琼脂糖，放入三角瓶中，加入30 mL × TBE缓冲液，置微波炉中加热至完全熔化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液。
(2) 胶板制备
① 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙），形成一个模具。