文档介绍：一、  基因工程
原理：基因重组
基因工程的基本工具
1“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）
（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列（一般为6个核苷酸的序列），并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2“分子缝合针”——DNA连接酶
(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：
①相同点：连接限制酶切开的磷酸二酯键。
②区别：
E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；
T4DNA连接酶来源于T4噬菌体，能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
与DNA聚合酶作用的异同:聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键（在DNA复制时）。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶与解旋酶的比较
项目
种类
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
解旋酶
作用底物
DNA分子
DNA片段
脱氧核苷酸
DNA分钟
作用部位
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对间得氢键
作用结果
形成粘性末端或平末端
形成重组DNA分子
形成新的DNA分子
形成单链DNA分子
3“分子运输车”——载体
（1）载体具备的条件：
①能在受体细胞（或宿主细胞）中稳定保存并大量复制。
②具有一至多个限制酶切位点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
（2）最常用的载体是质粒, 双链环状DNA分子，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟合DNA（或细菌染色体）之外，具有自我复制能力。
（3）其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒
基因工程的基本操作程序
第一步：目的基因的获取
1目的基因： 主要是编码蛋白质的结构基因 。
2获取：
（1）原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。
（2）获取目的基因的两种主要方法
① 从基因文库中获取目的基因
② PCR技术扩增目的基因
原理：DNA双链复制
过程（可了解）：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
第二步：基因表达载体的构建（基因工程的核心）
1目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
2组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因
（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。
（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。
第三步：将目的基因导入受体细胞_
导入原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
1转化的概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
2常用的转化方法：
将目的基因导入植物细胞： 农杆菌转化法（最常用的方法）， 基因枪法和 花粉管通道法等。
将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵。
将目的基因导入微生物细胞：如大肠杆菌，早期基因工程常用的方法。过程略
重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体的受体细胞的依据是标记基因是否表达，
第四步：目的基因的检测和表达
1首先要检测 转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交技术。
2其次还要检测 目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用 用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。
3最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取 蛋白质，用相应的 抗体进行抗原－抗体杂交。
4有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
（三）基因工程的应用
1植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。
2动物基因工程：提高动物生长