文档介绍：实验操作陈韵琳农杆菌电转法开电源按 STE 设电压( 1500v 农杆菌 18000v ) 用无水乙醇洗 3次点转杯在冰上晾干 100ul 感受态+1 μl质粒,提前混入放于电转杯中 Push2 ×两下时间在 5-6s 将 1mlLB 液体培养基加入电转杯中轻吸打 1-2 次,吸出放入离心管中 28 ℃摇菌 1h 4000rpm 2min 100 μl涂平板 28 ℃过夜培养挑单克隆,摇菌,进行 PCR 检测平板制备农杆菌平板的制备: LB100ml+kam ( 50mg/ml ) 100 μ l+RFP 利福平( 50mg/ml ) 100 μl潮霉素(Hyg) RFP 利福平( 50mg/ml ): 用 1ml 甲醇溶解,过滤灭菌 50mg/ml 卡那霉素(Kan):1g 卡那霉素+20ml 灭菌水(过滤灭菌) 胶回收/纯化? % 琼脂糖凝胶电泳电泳--上样--切胶--称重+同体积 mem bind ? 55 ℃-65 ℃水浴溶胶?倒入小柱--静止 1min-12000rcf1min ? 700 μ l men wash 12000rcf 1min ? 500 μ l men wash 12000rcf 1min ?空管离心 12000rcf2min ?换新离心管小柱中加入 50 μl去离子水静止 1min-12000rcf 1min 拟南芥的种植方法?种子放入 的离心管中+20 %漂水 1ml 强烈震动 20min , ?灭菌水冲洗 6次? %的琼脂糖悬浮种子,接种于 1/2MS 平板上,正放,在组培室培养 7 天,当种子长到 2叶一心时,种于土中(蛭石和土等体积,于 20min , 121 ℃高压灭菌),第 1,2 天用保鲜膜将培养钵的口封上,在其上留有通风孔, 8小时日照下进行营养生长 15-20 天,之后在 12 小时日照下进行生殖生长。质粒大肠杆菌热激法的转化?(1) 将质粒转入装有 100 μl感受态细胞的小离心管中,轻弹管壁混匀,冰浴 30min; ?(2)42 度水浴热击 60s, 迅速置于冰浴 2min ?(3) 加入室温的液体 LB 培养基 1000 μ l,混匀,37 度,150rpm 摇床培养 lh;4500rpm 离心 5min ?(4) 取 200 μL培养液涂布于含卡那霉素 50mg/L 的 LB 平板上,37 度培养 16h, 直至单菌落产生?大肠杆菌质粒的提取大肠杆菌质粒的提取(l)挑取在卡那霉素的 LB 平板上的单菌落,接种于 10ml 含有相应抗生素的 LB 液体培养基中,37 度,200rpm, 震荡培养过夜(8-12h); (2) 取 ml的过夜培养菌液,12000rpm 离心 2min, 弃上清; (3) 用 250ul 的 Solutionl( 含 RNaseAI) 充分悬浮细菌沉淀; (4) 加入 250ul 的 Solution11 轻轻的上下翻转混合 5一6次,使菌体充分裂解, 形成透明溶液;静止 2min (5) 加入 350ul 的 SolutionIII, 轻轻上下翻转混合 5一6次,室温静置 2min; (6) 室温 12000 rpm 离心 10min, 取上清;转移至 SpinColumn 中,12000rpm 离心 lmin, 弃滤液(将试剂盒中的 SpinColunm 安置于 eoxlection 管上) (7 )500 μl的 HB buffer 转移至 SpinColumn 中,12000rpm 离心 lmin, 弃?滤液;(8)将 700 μl的 wash buffer 加入 SpinColumn 中,12000rpm 离心 lmin, 弃滤液;重复操作此步骤(9)将 SPinColulnn 安置于新的 的离心管上,在 SPincofulnn 膜的中央处加入 50 μl的灭菌蒸馏水,室温静置 1min; ( 10 )12000rpm 离心 1min 洗脱 DNA 农杆菌感受态细胞的制备(l)农杆菌菌株划线培养,在农杆菌平板中进行(2)取单克隆,于 5 0ml LB 液体中加入利福平,28 度 180 rpm, 培养过夜;使 OD 达到 ; (3) 菌夜转入 50ml 离心管中, 4度,4 000rpm, 离心 10min, 弃上清液; (4) 弃上清, 10ml 无菌甘油( 20 %)悬浮细胞, 4度,4 000rpm, 离心 10min, 液;重复 3遍(5) 弃上清, 1ml 无菌甘油( 20 %)悬浮细胞, 每 50 μl分装为一管;-80度冰箱贮存各备用根癌农杆菌介导的杨树遗传转化程序(1) 工程菌液的制备挑取单菌落,接种到 1 0ml 相应抗生素的 LB