文档介绍：实验十七谷丙转氨酶活性测定 Activity Determination of Glutamic Pyruvic Transaminase 一、实验原理氨基移换酶也称转氨酶, 为广泛存在于生物机体内的酶,其作用为催化α- 氨基酸的α- 氨基与α- 酮酸的α- 酮基互换。因此在氨基酸的合成和分解,尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的种类甚多。任何一种氨基酸进行转氨作用时,都由其专一的转氨酶催化,它们的最适 pH接近。在各种转氨酶中,谷氨酸- 草酰乙酸转氨酶(简称谷草转氨酶)及谷氨酸- 丙酮酸转氨酶(简称谷丙转氨酶)活力最强。上述两种转氨酶均广泛存在于机体组织内, 在正常人血清中也有少量,机体发生肝炎。心肌梗塞等病变时,血清中转氨酶活力显著增加,所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。它们的催化反应如下: COOH COOH COOH COOH CH NH 2 + C=O C=O + CH NH 2 CH 3 (CH 2) 2 CH 3 (CH 2) 2 COOH COOH 转氨酶←→丙氨酸α-酮戊二酸丙酮酸谷氨酸→测定转氨酶活力的方法很多,如分光光度法,纸上层析法等。在本方法中,谷丙转氨酶作用于丙氨酸和α- 酮戊二酸后,生成的丙酮酸与 2,4 - 二硝基苯肼作用生成丙酮酸 2,4 -二硝基苯腙。本方法中用分光光度法,根据硝基苯腙的生成量可以计算酶的活力。二、实验用品 1、材料新鲜动物肝匀浆。 2、试剂(1) M磷酸缓冲液( pH= ) M KH 2 PO 4液50 ml , NaOH ml , 再加蒸馏水 ml ,混匀即得。(2)丙酮酸钠标准液( 微克分子/ ml ): 取A·R 丙酮酸钠 11 mg 溶解于 50 ml 磷酸缓冲液内(宜当日新配)。(3)谷丙转氨酶底物: 取分析纯α- 酮戊二酸 mg , DL —丙氨酸 g 置于小烧杯内,加 1 N NaOH 约10 ml 至完全溶解。用 1 N NaOH 或1 N HCl 校正其 pH= , M 磷酸缓冲液稀释至 100 ml , 然后加氯仿数滴防腐,在冰箱内可保存一周。此溶液每 ml 含α- 酮戊二酸微克分子,丙氨酸 200 微克分子。(4)2,4—二硝基苯肼溶液: 将A·R纯2,4—二硝基苯肼 mg 加入 200 ml 锥形瓶内, 加100 ml 1N HCl 液。 2,4—二硝基苯肼溶解较慢,把锥形瓶放在暗处不时摇动,全部溶解后,滤入褐色玻璃瓶。并置于冰箱中保存。(5) N氢氧化钠液。 3、仪器设备试管、吸量管、恒温水浴锅、分光光度计三、方法和步骤 1、肝匀浆制备: 取新鲜动物肝脏,用生理盐水冲洗,滤纸吸干,称取肝脏 g,剪成小块,置于玻璃匀浆管内,加入 ml预冷的 pH mol/L 磷酸缓冲液,制成 10% 肝匀浆,冰冻保存。 2、标准曲线的绘制取6 支试管分别用 0、1、2、3、5 标号,按下表所列次序添加各试剂。将试管于 37℃水浴中保温,平衡管内外温度, 向各管内加 ml 2 ,4—二硝基苯肼后再保温20分钟, 最后分别向各管内加入 N NaOH 5 毫升, 在室温下静置 30分钟后, 以0 号管做“空白”用520 nm 进行比色,读出光吸收值,以丙酮酸的微摩数为横坐标,光吸收值为纵坐标,画出标准曲线。管号试剂 012345 丙酮酸钠标准液/ml 谷丙转氨酶底物/ml 磷酸缓冲溶液( M ) /ml 37℃水浴中保温, 平衡管内外温度 2,4-二硝基苯肼/ ml 保温 20分钟 NaOH ( N)/ml 555555 静置 30分钟 A 520nm