文档介绍：华中农业大学
博士学位论文
棉花体胚同步发生及相关基因表达和蛋白磷酸化分析
姓名:曹景林
申请学位级别:博士
专业:作物遗传育种
指导教师:张献龙;曾汉来
20080501
摘要体细胞胚胎发生是体细胞向胚胎发生途径转变的发育再建过程,也是植物全能性预言的最好说明。体细胞胚发生现象被看作是开展生物学理论研究的良好模型。研究棉花体细胞胚发生对于阐明植物发育的分子机理,促进作物的遗传工程改良,无论在基础理论还是在实际应用价值上都具有极其重要的意义。以陆地棉品种为材料,对体细胞胚发生过程中的同步控制技术、组织细胞学、基因表达、蛋白质表达和磷酸化、酪蛋白激酶活性以及蛋白质双向电泳技术等进行了研究。研究结果如下:藁ㄌ逑赴咛シ⑸钠德实停姨逑赴叩姆⒂嬖谧挪煌叫裕细胞胚胎发生发育过程的生理学、生物化学和分子生物学的研究带来许多困难。以陆地棉品种为材料,首先筛选了适合体细胞胚胎发育的培养基配方,然后以此培养基为基本培养基,建立了一种简单有效的棉花体细胞胚高频率发生和同步发育的培养体系。经过多次继代获得的胚性愈伤首先在液体培养基中振荡培养使其分散,然后过目筛去除大的颗粒,重新悬浮于同样的液体培养基中。悬浮培螅可福干系呐咝杂酥匦∮谛孪实呐嘌校⒂梦芪悬浮液,将其均匀地接种在表面垫有滤纸的同成分固体培养基絅上。培养螅弥坑新酥降南嗤墓烫迮嘌檀培养。利用这种培养体系,获得的体细胞胚数量分别是单纯悬浮培养和固体培养垫滤纸倍和丁F渲校蛐闻摺⒂憷仔闻吆妥右杜叩耐椒⑸史直鹞月降孛奁分諧屡咧嵛M庵蔡逵盏加俗橹⒁越橛筛之间的胚性愈伤细胞团为材料进行单个细胞团培养,采用石蜡切片法观察棉花愈伤组织诱导和分化过程及体细胞胚发生和发育过程。结果显示棉花胚性愈伤组织有下胚轴两端发生、内发生、非胚性细胞转化、外发生和腺体处发生中纬赏揪叮其中两端发生和内发生是主要的形成方式,都是由下胚轴形成层细胞直接分化产生;棉花体细胞胚存在单细胞起源,多为表面发生,少量为内发生,并经历球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶胚龉蹋牒献优咝纬晒滔嗨啤C藁ㄌ逑赴叻⒂程中最关键的事件似乎是极性的建立、顶端分生组织的形成以及前形成层的分化和养蚈..ァ%
生长轴变化。球形胚时期表皮原层的分化标志着体细胞胚结构分化的开始。初始前形成层的形成是体细胞胚形态转变的第一个信号。球形胚内部等径细胞轴向延长,接着前形成层生长轴发生变化,这些是心形胚或椭圆形体胚中的重要事件。鱼雷形胚基本分生组织中液泡的出现丌始了组织分化的过程。三种主要的胚性组织系统包括芽顶端分生组织,根顶端分生组织和原形成层束在鱼雷形胚阶段清晰可见。随后鱼雷形胚上层分化形成芽原基和两个叶原基。子叶胚的维管组织从两片子叶伸向胚根,呈位験形。对一些停滞发育的球形胚和鱼雷形胚的解剖检查表明,极性建立可能是决定体细胞胚能否萌发的关键因素。谔逑赴咛シ⑸秃献优叻⒂墓讨校蘼凼桥咛シ⑸钠舳故桥咦体的形态建成都受到多种因子的调控,体细胞胚发生是一个由多种基因参与的复杂时空调节的发育途径。本研究从基因表达水平上对体细胞胚胎发生过程中所涉及的基因转录、转录后与翻译后修饰以及糖类、脂类及氨基酸与蛋白质的合成转运与代谢等生化进程进行了一定的分析。在所研究的个基因中,有个来自一个棉花的体细胞胚胎发生的目猓庑┗蛟诿藁ㄅ咝杂撕透魇逼谂咦刺逯杏胁钜表达,另外鯯蚝个基因来源于相关库。根据的实验结果,按目的基因的表达最高峰所对应的体细胞胚胎发生阶段可将这些基因分为啵与体细胞胚起始发生与形态建成相关。供试的基因中几乎所有涉及代谢与转运的基因均在这一阶段出现表达高峰,这与前人研究中体细胞胚发生过程中棵飨栽黾樱琑合成速率明显提高,种类丰富,氨基酸含量升高,蛋白质合成活跃的特征是不谋而合的,高水平的脂质转运蛋白更是成为体细胞胚发生的分子标记物质;后转录因子在体细胞胚的形成与发育阶段的高表达预示着其生命过程的复杂性。胩逑赴叻⒂氤墒煜喙亍4庸┦缘幕虮泶锔叻逅杂Φ胚胎发育阶段来看,体胚与合子胚的发育成熟过程中对后转录因子、、腺嘌呤、氨基酸与类脂物质代谢相关的基因需求量是不一致的。体细胞胚胎发育与成熟要求较高水平的细胞壁相关蛋白基因、腺嘌呤与氨基酸代谢相关基因与基因;以为代表的翻译后修饰基因在体细胞胚发育阶段的高表达被认为是复杂的蛋白质相互作用的标志,证明了体细胞胚的发育和成熟与起始发生和形态建成一样是相当复杂的。牒献优叻⒂喙亍:献优叩姆⒂统墒煲G蟾咚降孽;R泼福除蚐转录因子是体细胞胚胎发育所特有的,其余转录因子的表达水平在
关键词:两种类型的胚胎发育过程中没有明显特异之处。这可能与转录因子的岷嫌所能识别的顺势因子的差异有关。本研究结果首次证实了B家蜃雍虶蛋白在植物体细胞胚和合子胚发生发育中及在植物体细胞胚发生发育中的重要作用。编码基因在体细胞胚发育过程中的活跃表达,意味着在高