文档介绍：第三军医大学
博士学位论文
人胚胎视网膜感光前体细胞移植治疗视网膜色素变性的临床前
研究
姓名:刘勇
申请学位级别:博士
专业:眼科学
指导教师:阴正勤
2009-05
第三军医大学博士学位论文
人胚胎视网膜感光前体细胞移植治疗
视网膜色素变性的临床前研究*
摘要
视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是遗传性盲目最常见的病因之一。由于
RP患者视力持续性下降的原因是感光细胞的变性和凋亡,而感光细胞不能再生,移植
健康的视网膜组织或者细胞,已经成为目前最具前景的治疗策略[1]。已见报道的临床
试验因供体组织或细胞来源差异较大,结果也不尽相同,但都未有突破性进展。2006
年以来,多个视网膜移植中心的研究表明,处于特定时期的小鼠视网膜感光前体细胞
可以与病变的视网膜建立突触联系,有效改善宿主视功能,这一开创性基础研究为视
网膜移植临床试验指引了方向[2,3]。根据这一研究成果,如果能在人胚胎发育过程中
寻找到具有该特性的理想的RPP细胞,就有可能对临床视网膜移植带来推动作用。
临床视网膜移植疗效判断不一致的另一主要原因是缺乏客观的视功能评价方法。
因RP患者感光细胞功能微弱,常规的视觉电生理检查方法不能甄别受试者视功能的改
变,只能借助于心理物理学检查。感光细胞的功能评价包括视锥细胞和视杆细胞两大
部分,目前最敏感的多焦视网膜电图(multifocal electroretinogram ,mERG)仅能有效反映
部分RP患者的局部视锥细胞功能变化[4]。探索利用mERG分离视锥和视杆细胞电活动
[5,6],尝试对RP患者残存的视杆细胞的功能进行评估,可能有助于分析RP患者的视锥、
视杆细胞功能变化规律。当RP进一步发展,mERG也难以检测到局部视网膜电活动。
在哺乳动物(包括人类)非成像视觉传输系统中,外界光线照入眼内,会引起瞳孔短暂
收缩。随着外界光线强度的增加,瞳孔的收缩幅度会逐渐增大,瞳孔收缩强度是反映
视网膜和视神经功能的重要而灵敏的客观参数[7]。但瞳孔收缩强度能否客观量化评估
RP病人感光细胞功能,尚未见系统研究。
动物实验表明,小鼠视网膜感光前体细胞存在一个约1周左右的窗口期,该期细胞
具有一定的可塑性[3,8]。如何在人胚胎中获得该特定时期的视网膜感光前体细胞是开
展临床视网膜移植试验的前提,目前关于人胚胎视网膜感光细胞发育的生物学特性研
究较少,如何分离获得胚胎感光细胞也仅仅在动物实验中开展。因此,研究人胚胎视
*重庆市自然科学基金重点资助课题(2006BA5002)和第三军医大学第一附属医院临床创新基金资助项目
()
7
第三军医大学博士学位论文
网膜感光细胞发育变化,分离、纯化视网膜感光前体细胞,显得尤为重要。
综合上述研究和分析,本课题制定了“人胚胎感光细胞移植治疗视网膜色素变性的
临床前研究”的试验方案,本试验方案获第三军医大学西南医院医学伦理委员会通过,
并在世界卫生组织临床试验注册分部中国临床试验注册中心注册( 注册号
ChiCTR-TNC-00000193)。试验内容和研究结果如下:
1 建立了正常人视杆细胞mERG记录技术并应用于RP患者视功能检测。结果发现,
RP患者在常规闪光ERG呈熄灭型时,视锥mERG仍可检录出有效波形,检出率为
%,%。RP患者的视锥细胞mERG波描记阵列可
以大致分为中心型、偏中心型和不可记录型。中心型的1、2环振幅密度与中心视力呈
正相关。
2 自主研制了全视野光刺激瞳孔记录仪。根据视杆细胞和视锥细胞的光刺激特征,
采用短时程、渐进光亮度刺激RP患者视网膜,发现RP患者的瞳孔收缩强度均普遍低于
正常人;RP患者瞳孔收缩的光亮度阈值越低,其各个光刺激水平的瞳孔收缩强度越高。
在低亮度蓝光刺激下,瞳孔收缩强度与眼底自身荧光呈正相关;在中等亮度的白光刺
激下,瞳孔收缩强度与视野呈正相关;结果提示:暗适应全视野刺激下的瞳孔收缩强
度可以作为RP患者感光细胞功能的客观量化指标。
2 获得了高纯度的视网膜感光前体细胞。应用免疫组织化学方法,观察人视网膜发
育阶段的感光细胞成熟标志物opsin的表达变化,发现opsin在胚胎第16周左右的视网膜
外核层开始表达。随着视网膜发育成熟,其表达量逐渐增高。提示胚胎16周前的感光
细胞处于前体阶段。采用弱酶消化、震荡分离、差速贴壁等方法从胚胎12-16周的视网
膜中,获得了纯度达85%的人胚胎视网膜感光前体细胞;该细胞免疫细胞化学染色表
现为:CRX、NRL、Tuj