文档介绍：生化实验报告
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一、实验原理与冃的
植物受到机械损伤和病菌侵染后，ppo催化酚与a氧化形成为醍，使组织形成褐变，以便损伤恢复，防止或减少感染，提高抗病能力。但是PPO的存在是水果、蔬菜褐变的主要原因Z-,影响一些经济植物产品的质量。多酚氧化酶活性高低也是马铃薯解除休眠的指标z-o
本实验将采用马铃蓉为主要材料，通过细胞组织破碎匀浆、过滤、离心、硫酸钱沉淀、透析等步骤获得ppo的粗酶液。通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关仪器设备的操作使用，以及蛋白质的提取、分离的系统技术。
二、实验材料与试剂
1・材料：马铃薯（大约每小组100-200g）
2•试剂:・（，0. 001MEDTA, 5% 甘油，1%的聚乙烯毗咯烷酮）配制时配x 10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸鞍; 0. 03M 磷酸缓冲液
pH6. 0 （内含毓基乙醇,0. 001M EDTA, 0. 005M MgC12）配制时配X 10倍浓缩液100ml；0. 02M Tris-HCl缓冲液pH7. 4（内含0. 001M EDTA）配制时配X10倍浓缩液1000ml； NaCl；聚乙二醇：DEAE —纤维素DE52；葡聚糖凝胶 Sephadex G-200:
三、实验步骤
（1）粗酶提取：马铃萼丁按1:1 （W/V）比例与0. （内，0. 001MEDTA, 5%甘油，1%的聚乙烯毗咯烷酮）混合,匀浆后4层纱布过滤，滤液以6000rpm离心lOmin,弃除沉淀获得酶提取液。
（2）盐析分级沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸鞍使其达到40%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），然后6000rpm离心20min弃除沉淀；离心上清液再加入固体硫酸鞍达到70%饱和度（边加边搅拌达到充分溶解），再以6000rpm离心 20min,弃除上清液，收集粗酶沉淀；沉淀用0. 03M磷酸缓冲液pH6. 0 （内含0. 02M 毓基乙醇,0. 00IM EDTA, 0・005MMgC12）溶解，装入透析袋中用0. 02M KC1溶液透析至无硫酸鞍根离子，获得粗酶液供上柱使用。
四、实验结果
实验所得的初提酶液颜色为米黄色，较其他组的颜色浅。主耍是本组实验过程中特别是匀浆以前速度较快酚类被氧化的少；从而最大程度的保留了 PPO 的活性。
经过一个夜晚的透析，得到了澄清的略带黄色的液体。为进一步的柱层析提供了优良材料。
五、讨论与结论
1 •本实验在匀浆阶段应尽量快速，防止酚类充分暴露在空气中被氧化。
离心管的内盖一定耍盖严，否则在离心过程中会洒出来对离心机造成损害，离心Z前一定要仔细检查盖子是否合适。
加入硫酸镀固体时一定要注意用量的计算，第二步加入的时候起点浓度是40%而不是0,否则会加入过量，影响实验的结果。
实验2胰酶的分离提取
一、原理与冃的
提取制备胰酶的经典方法，多采用硫酸胺分级沉淀，胰酶在75%饱和度硫酸鞍中沉淀，其它杂蛋白一般在10%硫酸胺饱和度下被沉淀而除去。经多次提取，最后在PII8. 0硼酸缓冲液中得到结晶。，可在低温下储存较长时间而不失活；低于此PH酶易变性；高-T* PH5. 0时，酶易自溶而失活。因此提取制备胰酶的全部操作过程易在低PH和低温下进行。
本实验拟通过从猪胰脏屮制备胰酶结品实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备实验样品。
二、材料与试剂
材料：新鲜猪胰脏
2•试剂:PH2. 5乙酸酸化水、2. 5M H2S04溶液、2MNaOH溶液、5MNaOH溶液、
0. 1MHC1 溶液、0. 025M HC1 溶液、0. 01M HC1 溶液、0. 4M PH9. 0 硼酸缓冲液。
三、操作步骤
称取l-，在冰浴下剥除脂肪和结缔组织，粉碎除脏。加 -，检查提取液中PH,若高丁 %乙酸调节，-，在冷宅5°C 左右搅拌提取18—24h, 4层纱布过滤，一次（时间约为1 一 2h）合并滤液，。放置3 —5h后，，取上清，量其总体积。
盐析:加固体粉状硫酸钱，至40%饱和度盐析lhr, 12000rpm离心10mino 上清液加硫酸鞍，至75%饱和度盐析lhr, 12000rpm离心lOmin