文档介绍：实验一过氧化物酶同工酶的分离提取
一、实验目的
1、初步掌握蛋白质分离纯化的一般步骤,熟悉离心的使用及蛋白质提取中的注意事项。
2、了解过氧化物酶的作用。
二、原理:
过氧化物酶是植物提内普遍存在、活性较高的一种酶,它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系,在植物生长发育过程中,它的活性不断发生变化,因此测定这种酶的活性,可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
本实验以苜蓿种子为材料,低速离心去除细胞碎片,上清用***或硫酸铵沉淀得过氧化物酶同工酶粗品。
三、实验材料、器材及试剂:
(一)材料:苜蓿种子
(二)器材:研钵、超声波粉碎仪、高速冷冻离心机酸度计
(三)实验试剂:
1.***
PBS。
四、实验步骤
(若是苜蓿种子,提前用水溶胀好,)加15ml提取缓冲液匀浆;[先将种子称好研碎,再逐渐加入提取缓冲液,匀浆用去10ml,最后洗涤用5ml]
;
(量体积),沉淀弃去(清液少许低温保存测定酶活和含量样1);
-30℃预冷的***[事先放置在冰柜中],4℃放置30min;
,沉淀用3 ml M PBS回溶( 记录体积,留作实验二测含量和活性样2)低温保存;
-30℃预冷的***,4℃放置30min。13000g离心10min,沉淀。沉淀用5ml M PBS回溶(记录体积后,测含量和活性样3)低温保存。
五、实验结果与分析
第3步中清液的4ml,留取1ml作样品1。
第5步中回溶后体积为3ml,即为样品2。
第6步中回溶后体积为5ml,即为样品3。
实验二过氧化物酶同工酶含量测定
一、实验目的:
掌握用考马斯亮蓝G-250染色法测定酶含量的原理与方法。
二、实验原理:
考马斯亮蓝G-250(coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质酶含量属于染料结合法的一种。该染料在游离状态下呈红色,在稀酸溶液中当它与蛋白质的疏水区域结合后变为青色,前者最大吸收值在465nm,后者在595nm。在一定蛋白质浓度范围内(1~1000μg),
蛋白质与色素结合后在595nm吸光值的大小与蛋白质的浓度呈正比,故可用于蛋白质的定量测定。
考马斯亮蓝G-250与蛋白质的结合十分迅速,2min左右即可达到平衡,其结合物在室温下1小时内保持稳定。此法灵敏度高,易于操作,干扰物较少,是一种比较好的定量方法。其缺点是在蛋白质浓度太高时线形偏低,且不同来源蛋白质与色素的结合状况有一定差别。
三、实验材料、试剂和仪器设备
(一)材料
苜蓿种子
(二)仪器设备
722分光光度计烧杯量筒移液管具塞刻度试管
(三)试剂
(100μg/ ml)。
-250:
四、实验步骤
(一)标准曲线的绘制
取6支具塞刻度试管,按下表依次加入标准蛋白,向各管中加入考马斯亮蓝G-250溶液5ml,摇匀,放置5min左右,用1cm的比色皿在595nm处测定吸光值,以蛋白的μg作纵坐标,吸光值为横坐标绘制标准曲线。
表绘制标准曲线各试剂加入量
管号
1
2
3
4
5