文档介绍：实验十四 酪蛋白磷酸肽制备
设计性实验
一．原理
活性肽大都以非活性状态存在于蛋白质长链中,如果用适当的酶水解,可得到活性多肽。酪蛋白磷酸肽（简称CPPs)，就是以牛乳酪蛋白为原料,经单一酶或复合酶水解分离而得到的一种含有成簇磷酸丝氨酰基的多肽。该多肽的生理活性与分子中的氨基酸组成和排列顺序有关,同时又取决于CPPs制备工艺中所使用的酶，研究表明选用胰蛋白酶单酶法水解，CPPs具有较高的生物活性。
酪蛋白磷酸肽的生物活性表现为，在pH呈中性至微碱性的动物小肠下端,能与Ca+2、Fe+2+2等金属离子结合,阻止这些金属离子与磷酸根结合产生沉淀,使小肠内可溶性的钙、铁和锌的浓度增加,从而促进这些必需金属离子的吸收和利用。
多肽研究现状
具有生物活性的多肽，特别是短肽的发现和研究，已经成为多肽类药物和功能性食品添加剂开发和研究的热点与焦点。活性肽大多以非活性状态存在于蛋白质长链中，如果用适当的酶水解，它们的活性就被释放出来。近年来已经有很多具有生物活性的多肽通过蛋白质的消化被发现并分离出来。牛奶是大众食品，更是一种其它食品无法取代的营养品，牛乳中的酪蛋白，过去一直认为它仅仅只是营养蛋白，为生物提供氨基酸和氮源，很少注意到它是否可以经蛋白水解释放出活性肽，但目前众多的研究表明，通过不同的蛋白酶水解酪蛋白可以获得丰富的生物活性肽。这些活性肽中研究最多的是酪蛋白磷酸肽
关于胰酶和胰蛋白酶 分别代表两种不同酶（单酶和复酶），酶源广泛易得，价格也相对比较便宜。胰酶和胰蛋白酶提取自动物胰脏。
胰酶是由胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等构成的混合酶系，来源丰富，价格低廉。其中它的重要成分胰蛋白酶和糜蛋白酶（占90%以上）起水解作用。
胰蛋白酶主要通过胰酶的分离纯化得到，价格比胰酶要高，但它的专一性强，切割酪蛋白后产生的富含磷酸丝氨酸的短肽长度适中，既富集了磷酸丝氨酸基团，同时又使该肽段易于分离。
其它蛋白酶则由于切割位点不适合而难以得到富含磷酸丝氨酸的肽。此外，胰蛋白酶的最适PH在中性稍偏碱性区域，而在此PH范围内，酪蛋白的溶解度也比较大，有利于反应进行。在采用胰蛋白酶水解酪蛋白时，。
CPP的评价指标
由于CPP的功能性质（促进钙的吸收和利用）要通过体外模拟或活体动物实验才能给予评定，因此不适合作为评定指标。分子结构决定其功能性质，但多肽的测定非常复杂，因此CPP的分子结构也不可能作为评定的指标。酪蛋白分子中含有磷酸基的数目是一定的,N/P越小，则产品中不含磷酸基的肽段被切除和分离得越多，CPP的肽链就越短、产品的纯度也就越高。因此N/P值能较客观地反映CPP肽链的长短及磷酸基的密度，可作为CPP的特性指标。
功能: 其功能表现出抗龋齿、抗骨丢失、增强受精和胚胎发育等。是21世纪重点开发的药物和功能食品。酪蛋白——碱性蛋白酶水解体系是制备生物活性多肽——酪蛋白磷酸肽的有效酶解体系。美、日已将其作为补钙功能食品的原料，德国也将其列入药典。
Ca在肠道中必须以离子的形式才能被吸收，在小肠前段维生素D作为Ca吸收促进剂可加强Ca在小肠前段的主动吸收。而在小肠后段Ca的吸收形式是被动扩散，吸收效率取决于小肠内Ca离子的游离浓度。Ca在小肠后段中性至弱碱性环境中易与磷酸根离子结合形成不溶性盐而降低游离Ca离子的浓度使吸收率降低，CPPs在中性或弱碱性条件下其核心部位磷酸丝氨酸集中了大量的负电荷，能与钙、铁、锌等元素的二价离子螯合形成可溶性盐，提高矿物元素的溶解性，螯合物被肠壁细胞吸收后释放出矿物元素，从而提高了矿物元素的吸收和利用率，同时还可以有效地延长矿物质在体内的滞留时间。
CPPs抑制磷酸钙沉淀的机理的解释
磷酸钙沉淀在刚形成时是无定形的状态，然后逐步转变为晶体并长大，CPPs能黏附在无定形物的表面，抑制其进一步的成长，肠内的钙以很高的频率和CPPs不断接触、释放，保持游离状态，在不受磷酸根的作用状态下被带到肠粘膜。
CPPs与钙具有适度的结合，这样的结合强度使得CPPs分子中一个磷酸丝氨酰基可以保护30多个钙离子不被沉淀，并足以推动大量的溶解钙向肠黏膜转运，而又不至于因结合太紧密而影响钙的吸收。
依赖磷酸丝氨酸簇在小肠内与其他二价离子（铁、锌、锰、铜、硒等）形成可溶性络合物，依靠被动扩散增加这些元素被机体吸收的数量。
酪蛋白磷酸肽-磷酸钙溶液能凭借高钙浓度梯度促进牙釉质早期龋齿的再矿化，防止口腔细菌产生的酸对牙釉质的脱矿质作用，具有抗龋齿功能。具体原理为：CPPs磷酸丝氨酸簇结合钙后，以非晶体形式定位在牙