文档介绍：第一军医大学
博士学位论文
基因芯片用于鼠疫耶尔森菌检测的研究
姓名:黄海
申请学位级别:博士
专业:生物化学与分子生物学
指导教师:马文丽
20040501
英文缩写词表
开放阅读框聚丙烯酰胺凝胶电泳聚合酶链反应值光电倍增管聚乙烯吡咯烷酮限制性显示核糖核酸转/分钟标准柠檬酸盐蝗羌谆被淄单位微克微升溴氯一贿胚代半乳糖苷小肠结肠炎耶尔森菌鼠疫耶尔森菌假结核耶尔森菌毫升信使核苷酸光密度秒十二烷基硫酸钠琋,琋’募谆叶胺畉,—瓽畃琋,琋瓽..甀.。
摘要鼠疫是由鼠疫耶尔森菌所致的烈性传染病,曾在人类历史上三次大范围内的流行都已经得到有效的控制,但近年陆续又有一些自然疫源地复燃和新自然疫源地出现,以及可能被生物恐怖分子用作武器,使其仍认识,并在快速诊断和疫苗研制上取得了新的突破,才能从根本上遏制住它的再次大流行,现在利用基因芯片技术对鼠疫菌做进一步的研究仍基因芯片技术是上世纪年代兴起,源于计算机集成化芯片理念的一门新技术。实质就是利用体表面,有序地点阵排列大量椿騉探针。这些被固定在基质的探针上就形成了高密度⒄罅小Q稤或ü獗昙牵阵列上的探针进行杂交反应,按照碱基互补配对原则,探针特异性地结的信息,从而对基因序列及功能进行大规模、高通量、平行地研究。鼠疫耶尔森菌含有龉嫌胫虏⌒杂泄氐闹柿#,并且集中了多数已知的鼠疫致病性基因,我们直接利用其限制性片段,采用我们建立的巢式椒ń欣┰觯票赋龉┬酒蛴〉奶通过我们对芯片的杂交条件改进,取消标记样品的纯化过程,提高杂交温度从。陁在低严谨洗脱之前先使用蒸馏水冲洗,可有效提高酒脑咏谎粜孕藕牛档捅尘昂头翘匾煨愿扇拧L岣吡思测芯片的信噪比,使其特异性显著提高,获得可信的杂交结果。基因芯片结合技术,既快速又能在标记过程中实现样品扩增,发挥基因芯片高度灵敏、准确和简便快速的优点。同时平行检测多个基因,这对鼠疫这种烈性传染病的诊断提供新的科学方法。流行,并造成约谌怂劳觯澜缥V嚼酢9ゼ甘晔笠咴谌然是公众健康安全的隐患。因而我们需用分子生物学手段对该疾病重新具有现实意义。原理,以可寻址的方式在载合相应被荧光标记的分子。用激光激发荧光标记物,就可获得样品分子针,并结合马文丽、郑文岭等建立的限制性显示简称为际醣昙茄酚糜谑笠叩募觳狻
关键词:鼠疫耶尔森菌、基因芯片、诊断、表达谱、序列测定进行治觯范ǔ鍪笠呔钗L匾斓男蛄校靡陨杓瞥的寡核苷酸探针。固定探针在用多聚一焕蛋彼岽砉牟F希票成寡核苷酸基因芯片,同样采用技术进行样品标记,用以检测。通过我们对杂交条件的改进,能更好的降低非特异性杂交,结果显示,该云南的野生株之间已知毒性基因的表达差异,采用随机引物标记方法,片杂交,经比较分析,我们发现分离自我国云南的野生株的和『将分离自中国云南的两株菌和哉盏腅辏捎肔将覆盖操纵子的整个区域扩增,再以煌耆票段序列没有差别,显示这段序列对鼠疫菌是非常保守。综上所述,基因芯片技术用于鼠疫耶尔森菌研究,不仅为鼠疫的快速诊断提供了新的方法,在其表达谱分析中,也在野生株和株之间段序列的保守性。同时本文的工作对芯片的技术的改进提供了新的手段,进一步拓展了基因芯片在传染性疾病诊断中的应用范围。芯片具有很好的特异性。同时,我们将酒糜诒冉鲜笠呋钜呙缇闑头掷胱晕夜在逆转录合成第一链过程中,分别掺入疌一,并与芯基因有表达下调的趋势,株存在蛉笔В诜治鼋峁校为了确定野生株的和虻谋泶锶跤贓暝颍颐克隆文库,用测序仪测定后,拼接成完整序列,经治觯段序列在昃涿挥胁钜欤隚系腃蚄株的这确定了毒性基因的表达差异。通过对操纵子序列的测定,明确了该被验证。
.,曲’琣瓵,也,瑃琣,甈猙瑆琲甌甀甀...甌.ⅲ簐.,
。,%.瑃也琲。琱瓺,.—甌琌.,猦.—,.琤琣,瑆瓾。—猻
鋙篩,甀矾,.,哆琣畆甌猚,,,..緇。.,甀,,.辌
言引病,其传染性极强、发病快,病情凶险、死亡率极高的特点,被传染病防治法列为甲类传染病,同时也是一种典型的自然疫源性人兽共患病。临床上通常被分为腺鼠疫,败血型鼠疫和肺鼠疫,肺鼠疫就是曾引起中小时内结束生命。近几十年来鼠疫在我国已经得到了有效的控制,但近年陆续又有一些自然疫源地复燃和新自然疫源地出现的报道,对当地经济建设和人民群众健康都是安全隐患,同时在国外的自然疫源地近来也分离到耐药株。又赡鼙簧锟植婪肿幼魑9セ魑淦骼纳蔽薰嫉那在可能,使其仍在很大程度上威胁着人类的健康。东罗马帝卷整个欧洲大陆及地中海沿岸地区,这次大流行从公元甑年持续嗄辍>菔妨霞窃亍约有谌松ド恚鼠疫的第二次大流行,也即“黑死病”时期“4昕J剂餍校随后肆掠整个欧亚大陆,在中息,前后持续近辍5诙问澜缌欧洲的文明造成了巨大冲击,也使至今许