文档介绍：*
高通量测序样本
*
高通量测序样本准备的重要性
各种不同类型的样本
基因组DNA（resequencing）
宏基因组测序（也称微生物环境基因组，或元基因组）
cDNA
mRNA
miRNA
Methylation
ChIP-chip
Exon，Chrom
etc
代表性问题：原始样本的完整性与量的问题、各种偏性、误差、各种可能的污染等等。
*
高通量测序样本
*
测序样本制备的基本流程
样本核酸的获取（血液，组织，细胞，血清，……）
测序文库制备
DNA文库
mRNA文库
miRNA文库
片段选择文库
编码文库 barcode
测序模板制备
乳液PCR
桥式PCR
滚环扩增
步骤繁琐……
样本核酸准备
预处理（片段化，末端补齐，片段筛选等）
通用接头连接
文库的预扩增（包括反转录等）
文库的精确定量
测序模板制备（单分子多拷贝）
上机测序
进一步处理测序模板
*
高通量测序样本
*
第一节测序文库制备
样本核酸（DNA/cDNA）的质控标准
DNA: 完整性
Total RNA: 完整性（Agilent）
miRNA
Pretreatment
某测序公司原始样本需求
1. 所需Total RNA的量均不少于20μg/文库，Total RNA可以保存在DEPC处理过的水中、75%的乙醇、异丙醇中，具体以什么方式保存请注明。
2. 如提供实验材料为动物组织材料，样品质量需大于2g；
3. 如提供实验材料为植物样品，样品质量需大于4g；
4. 如提供实验材料为培养细胞，请提供1×107培养好的细胞；
5. 如提供实验材料为血液样品，请提供≥2ml的样品。
*
高通量测序样本
*
一、样本DNA等的片段化技术1、超声破碎技术
能量水平，时间，体积等参数
不足之处：
体积大
易污染
精度不够
*
高通量测序样本
*
Covaris S-series
2010年1月5日报道——安捷伦科技公司(NYSE: A)与Covaris 公司于今日宣布了签订一项合作开发市场协议，该协议表明，未来Covaris S2 DNA剪切技术将与安捷伦 SureSelect 靶向序列捕获系统一起销售，以提高新一代测序实验的效率。
Covaris Adaptive Focused Acoustics™ (AFA)
*
高通量测序样本
*
浓度不同
长度不同
物种不同
*
高通量测序样本
*
一些比较理想的结果
体会：
有很大的损失
不同的样本需要不同的优化，没有现成可直接用的条件
*
高通量测序样本
*
2、片段化酶
最初是利用限制性内切酶（Endodeoxyribonuclease）或DNA酶I（Deoxyribonuclease I）配合Mn2+将DNA大片段切割成小片段
针对新一代的高通量测序平台，已经有多家公司开发了配套的酶切试剂，多数是利用几种酶组合而成，其中包含一种可以在双链DNA上有随机识别位点的酶将双链DNA制造切口，然后由另外一种酶将切口处的单链DNA切断形成双链DN***段
Fragmentase：该片段化酶产品包含着两种不同功能的酶，其一可以实现在DNA双链分子上随机制造切口（nick），另一种酶可以识别这种切口并且在互补链对应处制造缺口，从而完全从该处断开双链DNA，从而实现只需根据反应时间的长短获得不同长度的DN***段，范围为100–800 bp DNA。不同的处理反应时间获得的长度有所差异，但是这种处理方法对原始样品的需求较大，而且对于目前主流的二代测序技术而言，还需要进一步切胶选择特定的片段，而且该商品对于不同样品的反应效果均一性有待进一步验证
*
高通量测序样本
*
Fragmentase（NEB）
Generates dsDNA breaks in a time-dependent manner to yield 100–800 bp DNA fragments depending on reaction time.
损失相对较小
集中程度不高，需要后续的片段选择
*
高通量测序样本
*