文档介绍：中山大学
博士学位论文
芽孢型益生菌黏膜疫苗平台的构建与生物学特性研究
姓名:李丽
申请学位级别:博士
专业:病原生物学
指导教师:余新炳
20090928
芽孢型益生菌黏膜疫苗平台的构建与生物学特性研究中文摘要专业:博士研究生:师:病原生物学李丽余新炳教授导枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性杆菌,为非致病菌,在营养缺乏时可形成芽孢,有独特抗性,能在高温、干燥、有害化学毒物等极端状态下存活。这些特性使得研制。芽孢疫苗的独特抗性使其更适合在发展中国家或某些不便于冷藏疫苗的紧急情况下使用。但由于受自身分泌蛋白酶多、构建的重组表达质粒不稳定等因素草芽孢杆菌作为基因工程表达系统发展迅速,为其作为疫苗载体的研究奠定了稳蛋白为模式抗原,利用枯草杆菌表达质粒将蚬菇ㄓ诳莶莞司挎咭驴腔駽舳蛹其编码序列的下游,在饷溉毕菥曛惺迪至送庠吹鞍譙在芽交叉置换整合于枯草杆菌染色体,与或融合表达于芽孢衣壳外表面;同时利用枯草杆菌舳邮迪至薙在繁殖体细胞内表达。免疫学水平实验证明,呙绾蜓≈昕诜⒌伪敲庖咝∈竽芤鹣低澈宛つっ庖叻此外,本文利用枯草芽孢杆菌内生芽孢构建了多价抗原融合表达体系,选用目前作为益生菌广泛用于人和动物。成熟的枯草杆菌芽孢处于代谢静止状态,具芽孢可作为传递外源抗原至肠胃等极端环境的理想载体,因而被用于疫苗载体的影响,使其应用受到一定限制。近年来,随着分子生物学和基因工程的发展,枯固的基础,并展现出良好的应用前景。本文以日本血吸虫孢衣壳表面高表达。利用穿梭整合质粒玈通过双应,以V鞯嫉腡/旌闲兔庖叻从Α破伤风毒素魑C庖咦艏练肿樱隨基因融合后以三种形式中山笱Р┦垦宦畚芽孢型益生菌粘膜疫苗平台的构建与生物学特性研究
本研究获得国家自然科学基金、国家“奔苹甆构建表达体系:在芽孢外表面展示胙挎逤駽饪堑鞍兹诤媳泶;荧光免疫学实验、激光共聚焦显微镜检测到外源蛋白在芽孢外表面成功地表达,同时也证明了多价重组抗原的大分子结构不影响芽孢外层蛋白的组装和芽孢形本文还评估了芽孢的免疫佐剂效应。我们利用分子信息学进行分析并用实验方法检测了芽孢杆菌不同种属的物理化学特性,选择枯草芽孢杆菌,,证实了芽孢对蛋白的吸附作用,用吸附蛋白的芽孢滴鼻免疫小鼠能引起强烈的黏膜免疫反应,在肺组织、粪便、唾液中均能检测到高水平的匾煨詓姆置凇合型免疫反应。利用此免疫反应诱导的均衡蚑反应,有利于提升日本非特异性免疫水平,能调节免疫反应类型。,但由于其吸附的抗原蛋白不能通过胃屏障,只能以滴鼻形式免疫而本文通过构建多种芽孢疫苗技术平台,实现了外源蛋白在重组枯草杆菌的芽孢衣壳展示和繁殖体的双功能表达,并使用不同的黏膜免疫方式进行了免疫学评价。研究表明,,滴鼻免疫是最佳接种方式,小剂量的接种能引起强菌芽孢黏膜疫苗平台和免疫学评价体系,为芽孢杆菌表达系统提供了应用指导,为研发高效的第二代抗日本血吸虫疫苗提供了理论基础,并为研发其他感染性疾关键词:枯草杆菌;芽孢;疫苗;黏膜免疫;日本血吸虫;破伤风毒素、国家‘奔苹.⒐医ㄉ韪咚酱笱Ч裳芯可目甗的资助。在芽孢萌发为繁殖体中的表达;以及芽孢与繁殖体双转构建相结合的方式表达。成。同时,也能激发小鼠系统免疫反应,抢嗵崾疚R訲占主导的疶混血吸虫免疫保护作用。证实了芽孢作为新型黏膜疫苗佐剂,能提高机体特异性和使其应用受到一定限制。的双转表达,使用三次剂量足以刺激小鼠产生匾煨悦庖叻从Α4送猓烈地特异性地系统、黏膜免疫反应和细胞免疫反应。本文构建的多种形式的益生病的创新型益生菌芽孢黏膜疫苗提供了新思路和技术平台。中山大学博十学位论文芽孢型益生菌粘膜疫苗平台的构建与生物学特性研究
.琩:篖:.—.,甌甌,.
痯/··痯籸猂琒,..“./.—:,·甀猵甤疌.,.”琤
州築籘.【.中山大学博十学位论文芽孢犁I衬ひ咦缕教ǖ墓菇镅匦匝芯瑂甒,,,瓸甌瓼,猺,,;籱;
符号与缩略语说明抗原递呈细胞氨苄青霉素碱基对基本局部比对搜索工具馨拖赴鸆馨拖赴鸆菌落形成单位二氨基联苯胺芽孢培养基二硫代苏糖醇酶联免疫吸附实验表达序列标签美国食品和药物管理局异硫氰酸荧光素谷胱甘肽巯基转移酶辣根过氧化物酶异丙基硫代半乳糖苷中山大学博士学位论文铝剂牛血清白蛋白编码序列—氯霉素脱氧核糖核苷磷酸红霉素肠相关淋巴组织干扰素狣嘌淋巴结芽孢型益生菌粘膜疫苗平台的构建与生物学特性研究琣瑄/
主要组织相容性复合体标准差聚丙烯酰胺凝胶电泳破伤风毒素赴產黏膜相关淋巴组织光密度开放阅读框磷酸盐缓冲液聚合酶链反应苯甲基磺酰