文档介绍：实验6 酵母核糖核酸的分离 及组分鉴定
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一、实验目的
掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程。
了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。
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二、实验原理
由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。此法能较好地除去DNA和蛋白质，提取的RNA具有生物活性。
酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，%~%，而DNA含量较少，%~%。为此提取RNA多以酵母为原料。工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。
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稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，。提取的RNA有不同程度的降解。浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。
二、实验原理
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RNA含有核糖、嘌呤碱/嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，加钼酸铵沉淀（或用定磷法）和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。（1）嘌呤碱与硝酸银作用产生白色的嘌呤银化合物沉淀。（2）地衣酚显色法：核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与地衣酚（3，5-二羟基甲苯）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂。（3）磷酸与钼酸铵试剂作用产生黄色的磷钼酸铵沉淀[(NH4)3PO4·12MoO3↓]。
二、实验原理
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三、仪器、原料和试剂
仪器：试管；试管架；100mL氢氧化钠烧杯；（×1）、（×2）、1mL（×2）； 量筒10 mL、50mL各一个；滴管；水浴锅；离心机；布氏漏斗。
原料：干酵母粉
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三、仪器、原料和试剂
试剂：
（1）%氢氧化钠溶液；
（2）95%乙醇；
（3）乙酸、乙醚；
（4）10%硫酸；
（5）；
（6）1mol/L浓氨水；
（7）酸性乙醇溶液： HCl；
（8）三氯化铁-浓盐酸溶液：将2mL 10％三氯化铁（FeCl3· 6H2O）溶 液加入400mL浓HCl中；
（9）地衣酚-乙醇溶液：称取6g地衣酚溶于100mL 95％乙醇；
（10） 钼酸铵试剂：将2g钼酸铵溶解在100mL10%硫酸中。
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四、实验步骤
1、酵母RNA的提取
称4g干酵母粉悬浮于40mL %NaOH 溶液中并在研钵中研磨均匀。悬浮液转入100mL烧杯中 沸水浴加热30分钟，不断搅拌。冷却，3000r/min离心10-15分钟后，将上清液慢慢倾入10mL酸性乙醇，边加边搅。加毕，静置，待RNA完全沉淀，3000r/min离心3min。弃去上清，用95%乙醇洗涤沉淀两次（每次约10ml），继而用无水乙醚洗两次（每次10ml），洗涤时可用细玻璃棒小心搅动沉淀。用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量。
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2．RNA组分鉴定
水解RNA：~1g提取的核酸，加入10%硫酸10mL沸水浴加热10分钟制成水解液，然后进行组份鉴定。
（1）嘌呤碱：取一支试管，加入1mL水解液， 加入过量浓氨水（约2mL）。然后加入1mL ，观察有无嘌呤碱银化合物沉淀。
（2）核糖：取一支试管，加入水解液1mL，。放沸水浴中10min。注意观察核糖是否变成绿色。
（3）磷酸：取一支试管，加入2mL水解液，然后加入5滴硝酸银和1mL钼酸铵溶液后，在沸水浴中加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀。
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五、计算
RNA提取率（%）=RNA质量（g）/干酵母粉质量（g）×100%
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