文档介绍：Q-PCR实验流程
①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-２0分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNＡ抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75％乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。
总RNA抽提
1）细胞培养皿中细胞样品用１＊PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1mｌＴrｉzｏｌ　(Invｉtrogen）溶液，吹打混匀，　ＲNasｅ freｅ　ＥＰ管中使细胞充分裂解,室温静置5ｍin;
组织样品用液氮充分研磨，加入1ml　Tｒｉzｏｌ (Ｉnvitrogｅｎ）溶液，混匀，室温放置5ｍｉｎ使其充分裂解;（管盖与管壁都需标记样品名称)
加入200μl***仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5miｎ;（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）
3） 4℃下，14,０00g离心１5ｍiｎ，可见分为三层，RＮＡ在上层水相，移至另一个新的ＲNasｅ　　free EＰ管;（用２0-20０ｕｌ的枪吸取上清,吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清,枪头不可碰到、吸到中间层）
沉淀RNA:加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒６－8次)（不应用振荡器混匀），室温静置１0miｎ；
4℃下，14，000ｇ离心10min，收集RNA沉淀(如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在—８0度冰箱过夜，继续在４℃下，1４,00０g离心10mｉn，收集RＮA沉淀）,去上清;
用75％乙醇洗涤两次（12,0０0g离心5min)（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可,不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿,过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
视沉淀量加入适量DEＰC水(至少15ul）溶解沉淀。
三、去基因组
使用RＮase—fｒee的DNase І（Promega)，按以下体系配置反应液,37℃消化30ｍin，65℃灭活10ｍin.
RNA 　
DNasｅ І 　　
10 x ｂuｆfeｒ　　
H2O(RNase free）
RＮａsin　
3０
2０
10
39。５
0。５
µl
µl
µｌ
µl
µl
总体积
１００
µl
　　然后按以下步骤操作:
1）加入等体积的苯酚/***仿,上下颠倒混匀，室温放置5min,后１4，000rpm，离心15min，取上清。
2）加入等体积的***仿，上下颠倒混匀，静置分层后1４,000rpm,离心１５mｉn，取上清。
加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6—8次）,—20℃静置15min;
4℃下,１4，０00g离心１５miｎ,收集ＲNA沉淀,去上清；
用7５%乙醇洗涤两次（１2，０00g离心5min），超净台风干；
加入适量DEＰC水(至少１5ｕｌ)溶解沉淀。
四、总RNＡ纯度和完整性检测
纯度检测：取1μl