文档介绍：测序引物设计指南
♦ＰＣR引物设计方法：
１．引物最好在模板ｃＤNＡ的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在ＮCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件(比如DNAｍaｎ)比对（Ａliｇnment)，各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2。引物长度一般在１5~30碱基之间。
引物长度（ｐｒimerlengｔh)常用的是１8-27bｐ，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaｑDNA聚合酶进行反应。
%~60％之间，Tｍ值最好接近7２℃。
ＧC含量（comｐｏsitｉon）过高或过低都不利于引发反应。，上下游引物的Tｍ值（meｌtingtempｅrａture）是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tｍ值5～1０℃。若按公式Ｔｍ=4（G＋C）+２（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为５5～80℃,其Ｔm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域，引物３′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。
５．引物３′端不能选择A，最好选择T。
引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时,错配的引发效率大大降低，G和C错配的引发效率介于Ａ、Ｔ之间，所以3′端最好选择T。
。
        　引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是３’端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发(Falsepriｍing）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。
７。引物自身及引物之间不应存在互补序列。
        引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构(Ｈairpｉn）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体(Diｍer与Ｃｒoｓsdimeｒ）。
       　引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8。引物5′ 端和中间△Ｇ值应该相对较高,而３′　端△G值较低。
        △G值是指DNA双链形成所需的自由能,它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,△G值越大，则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高,而３′端△Ｇ值较低(绝对值不超过9）的引物。引物3′端的△G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DＮA聚合反应。(不同位置的△G值可以用Olｉgｏ６软件进行分析)
′ 端可以修饰,而３′ 端不可修饰。
       　引物的5′端决定着ＰCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大