文档介绍：2021/2/2
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二什么是目的基因
基因工程的主要目的是使优良性状相关的基因聚集在同一生物体中，创造出具有高度应用价值的新物种。为此必须从现有生物群体中，根据需要分离出此类基因，即准备要分离、改造、扩增或表达的基因通常称之为目的基因。
如抗逆性相关基因（抗病、抗寒等）、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因、工业用酶等相关基因等。
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一般来说，目的基因的制备战略分为两大类
一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；
另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。
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第一节目的基因的制备
1、直接法制备基因
2、从基因组文库中钓取目的基因
3、从cDNA文库中钓取目的基因
4、通过PCR直接扩增出目的基因
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限制性核酸内切酶酶切分离法
限制性内切酶酶切分离法适于从简单基因组（如质粒和病毒）中分离目的基因。
①对已定序的DNA分子，只需用已知识别序列的限制性核酸内切酶进行一次或几次切割，分离纯化所需DN***段，与适当载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆。
②对已知定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的限制性内切酶识别位点，用适当的限制性内切酶切割，一次就可获得目的基因。
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所谓基因就是具有特定生物学功能的一段核苷酸序列，所以只要掌握了其分子结构，完全可以在实验室进行人工合成。
1977年，利用化学途径首次合成了编码脑激素的基因（生长激素释放因子基因），并在大肠杆菌中实现了成功的表达。从此，化学合成基因得到了很大的发展迅速。
早期通过化学合成的部分基因
基因
人胰岛素
转运RNA
-干扰素
肠促胰液肽
尿抑胃激素
-干扰素
大小（bp）
126
542
81
162
453
合成年代
1978
1979
1981
1982
1982
1984
基因
视紫红质
前脑菲肽
ATP酶
溶菌酶
RNA酶T1
RNA酶Ａ
大小（bp）
1057
77
170
385
324
375
合成年代
1985
1985
1985
1985
1986
1987
化学法直接合成基因
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：
混合退火
根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段
T4-DNA连接酶连接
克隆入合适的载体
化学合成法的基本战略
全基因合成有三种战略：
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混合退火
T4-DNA连接酶连接
克隆入合适的载体
Klenow酶聚合
补钉延长法
根据目的基因两条互补链全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段以及20-30碱基长的单链DNA中片段
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根据目的基因的全序列，分别合成40-50碱基长的单链DN***段
混合退火
T4-DNA连接酶连接
克隆入合适的载体
Klenow酶聚合
大片段酶促法
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三种方法各有利弊
化学合成DNA的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份额较大，成本较高；在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小，成本较低，但大片段化学合成的收率极低，例如，每聚合一个单体的产物收率为95%%
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化学合成的单元操作
化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩