文档介绍：上海交通大学
博士后学位论文
Smac/Survivin信号通路对肝癌细胞凋亡调控机制的研究
姓名:戴德坚
申请学位级别:博士后
专业:普通外科学
指导教师:彭志海
20071201
/信号通路对肝癌细胞凋亡调控机制的研究上海交通大学附属第一人民医院普外科博士后:导师:戴德坚彭志海教授中文摘要逃避凋亡是肿瘤获得恶性转化的重要机制,起凋亡信号桥接作用的线粒体凋亡信号通路是肿瘤凋亡机制获得突破的主要问题,新的凋亡抑制基因着重要调控作用。然而/线粒体信号路径中的关键机制有待进一步阐明。最新研究表明,高表达于肝癌细胞系及人肝癌组织,而则本研究试图建立稳定表达蛋白的肝癌细胞系并联合顺铂培养,来阐明肝癌细胞初始凋亡信号经线粒体介导以蛋白为核心的释放机制,这是细胞外凋亡信号转导到细胞内的必要条件;其次,尽管和可能存在相互作用,以多聚复合物的形式转导凋亡信号,但必须明确其组成,这是细胞内凋亡信方法和结果本课题分以下几部分研究:研究一:重组质粒的构建及肝癌细胞凋亡早期蛋白从线粒体膜释放动力学机制研究。背景和目的和与之相拮抗的凋亡活化基因参与了线粒体凋亡信号通路的组成,并发挥低表达,这与肝癌细胞增殖和凋亡密切相关,也是其对放化疗不敏感的原因之一。号转导到凋亡终端效应器必要前提;最后要阐明上游和下游的激活机制,这是细胞发生凋亡的中心环节。方法:构建在肝癌细胞系赴榷ū泶颯鞍椎膒刈质粒,真核表达质粒双酶切、┰龊图す夤簿劢瓜晕⒕导觳庋橹ぁSü庵柿博士后出站工作报告
转染赴⒘:纤巢嘌巢碜樽鞫哉铡Sτ没钕赴す夤簿交显微镜实时观察肝癌细胞凋亡早期蛋白分子从线粒体膜释放的动态过细胞凋亡早期,活细胞激光共聚交显微镜检测发现:无顺铂处理组,线粒体膜间红色荧光,两者重叠后表现为强的黄色荧光。而顺铂处理组,由于/从线粒体膜内间隙释放,黄色荧光随时间逐渐减弱,胞浆内观察到绿色荧光并逐入顺铂诱导凋亡后分钟,胞浆内绿色荧光逐渐增强,提示/由线粒体膜间隙向胞浆内逐步释放;强的绿色荧光可维持分钟,同时较强黄色研究二:肝癌细胞凋亡中期的/多聚复合物形成及凋亡信号转方法:稳定表达蛋白肝癌细胞系9媾嘌:纤巢嘌赴雒庖吖渤恋砗螅悦庖吖渤恋聿猙觳狻7直鹩肧固澹琒固澹琧—固澹琧一;同时用抗抗体共沉淀下来的产物中可以检测到,接着程。结果:构建的重组质粒经退盖屑ㄕ泛螅晒ψH赴担玫轿榷ū泶颯鞍椎母伟┫赴礖,在顺铂诱导隙发绿色荧光疍,而线粒体膜因为转染—渐增强。连续实时监测,间隔秒观察记录一次。对照组分钟内都显示较强黄色荧光,而绿色荧光一直较弱,提示/在线粒体膜间隙;实验组加荧光渐渐变弱,在加入顺铂诱导凋亡后分钟,黄绿荧光强度相当,提示该时间点为/从线粒体膜间隙向胞浆内释放的关键点。导机制的研究裂解,未处理赴鞫哉铡J褂肧固宄恋硐赴谒杏隨岷系牡白质,分别用抗体,抗体,固搴蚦一固宸肿樽雒庖共沉淀实验,应用方法鉴定这些蛋白混合物的组成、释放细胞色素虲。以明确转导凋亡信号的多聚复合物的组成及它们之间相互作用关系。结果:应用—抗体分组进行后发现:在用抗抗体共沉淀下来的产物中可以检测到我们进行固澹琧抗体的检测均可见和。体外实验充分证实了//痗之间存在着相互作用博士后出站工作报告
研究三:肝癌细胞凋亡晚期的/多聚复合物介导肝癌细胞凋亡分子机制的研究方法:应用方法分析猚,蚦,增殖周期和凋亡的影响,以明确多聚复合物介导赴蛲龅姆肿踊啤发现:未用顺铂处理的赴鱿諴—和猚醮分钟后再次检测未见改变;但加入顺铂诱导转染了稳定表达蛋白伟巢盏几伟┫赴蛲龉讨校诘蛲鲈缙冢赴獬跏嫉蛲鲂藕啪吡伟┫赴诘蛲龉讨校蛲黾せ钜蜃/猚/偷蛲应用流式细胞仪同步分析,顺铂的诱导对稳定表达蛋白肝癌细胞系结果:通过对猚一和,钚缘腤检测细胞后分钟,即可见少量裂解产生和开始出现,在顺铂诱导凋亡后分钟,可见裂解产生和明显变浓条带。同步转染细胞周期分析显示:经顺铂诱导转染蛋白的肝癌细胞后,细胞周期产生明显变化,在顺铂处理前,表达蛋白肝癌细胞先出现细胞周期阻滞期和/,后凋亡不明显;处理后,诤虶疢期阻滞被加强,出现细胞快速凋亡。结论体介导,通过释放凋亡激活因子,将细胞凋亡信号传导到细胞内。抑制因子相互作用形成凋亡信号转导复合物,后者作用于ǖ剂矗⑸读7糯蠓从Γ贾孪赴蛲觥凋亡激活因子和凋亡抑制因子在肝癌细胞线粒体凋亡信号通路中发挥重要调控作用。肧蚐ノ^卓构叵担捎猛闭攵許蚐白的分子干预是一个非常合理的治疗策略。博士后出站工作报告
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