文档介绍：FISH (荧光原位杂交)技术全攻略
荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization, FISH)是一种 应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示核 酸序列位置的方法。该技术问世与70年代中期左右，其曾多于与染色体 异常的研究，近年来随着FISH探针种类的不断增多，使得该技术逐步应 用于各种领域。该技术具有快速，安全，灵敏度高以及探针可长期保存等 特点，目前已广泛应用于细胞遗传学，肿瘤生物学，基因定位，基因作图， 基因扩增及分子诊断等领域。
1对于FISH操作来说，那些因素比较重要？
在FISH中最重要的因素是温度、光照、湿度和各种试剂的PH值。温 度和湿度直接影响着探针和目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料 的强度，因此探针要避光保存，其已经杂交的片子可用防荧光淬灭剂封片 且避光保存；各种试剂pH也要精确达到要求，这也直接关系到FISH的稳 定性。
2如何保证FISH操作中的温度？
最佳的措施是使用一些FISH的专用仪器进行操作，如Vysis的Hybrit FISH杂交仪。如果是手工操作，首先要对FISH操作过程中可能使用的一 些仪器进行温控能力的检查，如水浴锅、孵箱，对其中不符合要求的要进 行更换()。其次，要尽可能 地保持操作环境温度在20度以上，对于在冬季进行的FISH操作尤为重要。 此外对于需要预热以达到要求温度的试剂，在使用前必须使用温度计对其 进行测温。同时检测的样本最好不能超过4块。操作中的行动一定要迅速。 操作者还往往忽视一些小部件的温度，诸如载玻片和盖玻片。特别是在冬 季，盖玻片本身温度就低，加之探针的量本就不多(10ul),因此事先没有 预热的盖玻片会使得杂交液的温度急剧下降严重地影响了探针和目标
DNA的杂交效率。因此对上述小部件的要进行预热处理，不然会影响FISH 的杂交效果。
3使用荧光显微镜观察结果时，最初有清晰而明亮的信号，但随后信号急 剧衰减，几分钟后信号就消失了。这是探针本身的质量问题吗？
正常情况下，商业化探针即使是杂交后，如保存适当，荧光信号能保 持半年以上。出现上述情况主要的原因是操作观察的过程中或是探针的保 存过程中没有采取严格的避光措施。阳光或是强的灯光都会使荧光染料发 生急剧的淬灭，从而造成了观察结果的不稳定。因此在操作和观察时，尽 可能在暗室中操作，也可以在封片观察时加入一定的antifade （抗淬灭剂） 以延缓荧光素的淬灭。
4如何配制各种试剂呢？
强烈建议使用灭菌去离子水配制各种所需的试剂。此外，配制后使用 pH计检测是否符合要求。配制的各种试剂都要采用超纯级要求。每次FISH 使用新的试剂，旧的试剂最好弃置不用。洗脱液和变性液当天用当天配。
5直标型探针和间标型探针有何不同？
为什么我们要选择直标型探针？所谓的直标型探针是指DNA探针共 价连接荧光素基团；间标型探针则是指DNA探针先与某个半抗原连接， 诸如生物素或***，然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针一半抗 原一荧光素基团，类似“三明治”的复合物。与间标型探针相比，直标型探 针具有低背景、高特异性的特点。随着荧光染料和荧光检测技术的不断发 展，直标型探针的灵敏度也不断提高。因而在FISH检测领域，尤其