文档介绍：谨以此论文献给谆谆教导我的老师们,以及实验室
所有给予我莫大帮助和鼓励的朋友们!
刘旭雅
两株溶藻弧菌对对虾抗 WSSV 差异的分子作用机制的
研究
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签字日期: 年月日签字日期: 年月日
两株溶藻弧菌对对虾抗 WSSV 感染作用差异的分子作用机制
的研究
摘要
益生菌在水产界以得到了广泛的应用和认可,也以逐步成为了对虾控制病害
的主要手段之一。现阶段,对于益生菌开发的种类已经非常的丰富,但是益生菌
的作用机制,还不是很清楚,多处于摸索阶段。溶藻弧菌产益生菌以作为水被认
可和应用,本实验基于实验室已有对溶藻弧菌投喂饲料对对虾抗 WSSV 感染的研
究结果差异为依据,不同溶藻弧菌菌株对对虾抗 WSSV 的作用相差很大,本研究
通过两株菌株的差异比较,本研究通过分子生物学技术手段,寻找到菌株间存在
的胞外、胞内蛋白、多糖之间的差异,进一步确定两株菌株的胞外蛋白中的丝氨
酸蛋白酶、胞外多糖等物质存在明显的差异。通过结果显示,溶藻弧菌的胞外产
物对对虾抗病作用具有重要的价值。本研究为益生菌的筛选起到了一定的指示作
用,并对益生菌的发酵和益生菌中的代谢产物中有价值的物质的进一步利用提供
了一定的参考价值。
本实验共分为几部分:利用 16S 技术、16-23S 技术对菌种进行鉴定,利用
SDS-PAGE,质谱技术对菌体蛋白、外膜蛋白、胞外分泌蛋白及胞外多糖进行分离
及种类鉴定,对差异蛋白进行人工重组诱导纯化,通过养殖侵染免疫实验,免疫
作用验证蛋白的功能。
内容和方法分为以下几个方面:
1 通过 16sDNA 分子基因序列分析、结合 16S-23RDNA 分子手段将两株溶藻
弧菌鉴定到亚种。确定两株分离自凡纳滨对虾肠道的两株菌为溶藻弧菌不同
株,其 16-23SRNA 之间存在差异对于细菌的鉴定还有很多技术手段。
2 利用 16S-23rDNA 分子手段及 RFLP 技术将多株溶藻弧菌鉴定进行鉴定。
将分离的多株溶藻弧菌的鉴定还有很多技术手段,利用 RFLP 技术将
16-23SrDNA 不能分离的菌株得到了进一步的分离,该分子手段结合很好的将
亚种进一步的得到了分离,为溶藻弧菌的菌株鉴定进行具有一定的作用。
3 通过 SDS-PAGE、质谱分析等手段对溶藻弧菌进行蛋白的分离,找出差异蛋
白,进一步通过质谱分析鉴定出蛋白条带差异带为丝氨酸蛋白酶,丝氨酸蛋白酶
为免疫中的重要物质,具有天然的抗病毒作用,进一步推测溶藻弧菌中的胞外产
物中的丝氨酸蛋白酶具有抗病毒对虾 WSSV 的作用,但由于其占胞外总蛋白含量
较低,推测其丝氨酸蛋白酶的作用还需进一步验证。
4 通过 SDS-PAGE、质谱分析等手段对溶藻弧菌全蛋白进行蛋白的分离,找出
差异蛋白通过质谱分析鉴定出蛋白条带为铁载体蛋白,通过人工重组铁蛋白质粒
技术,将 FER 基因克隆并表达至载体 pBAD/gIIIA 中,构成重组载 pBAD/gIIIA-FER
之质粒。将重组载体转化入大肠杆菌 Top10 中进行原核表达,纯化得到人工重组
铁载体蛋白, 在阿拉伯糖的诱导下,通过 Western-blo