文档介绍：华中科技大学
博士学位论文
SOCS干预对IUGR大鼠骨骼肌细胞代谢的影响及机制研究
姓名:廖立红
申请学位级别:博士
专业:儿科学
指导教师:罗小平
2011-05
华中科技大学博士学位论文
SOCS 干预对 IUGR 大鼠骨骼肌细胞代谢的作用及机制研究
中文摘要
第一部分宫内发育迟缓大鼠骨骼肌细胞的原代培养与鉴定
目的宫内发育迟缓大鼠骨骼肌细胞的原代培养及鉴定,研究其胰岛素信号通路
中胰岛素受体底物-1(IRS-1),细胞信号转导抑制分子-1(SOCS-1)和-3(SOCS-3)的表达
变化,初步探讨胰岛素抵抗发生发展的机制。
方法采用母孕期饥饿法建立 IUGR 大鼠模型。以正常新生鼠作为对照,组织块
翻转干涸培养法体外原代培养大鼠骨骼肌细胞,运用运用 SABC 法对骨骼肌细胞作肌
动蛋白免疫组织化学染色进行鉴定。通过 Real-time PCR 和 Western blot 检测新生和
12 周龄 IUGR 大鼠骨骼肌细胞 IRS-1、SOCS-1、SOCS-3mRNA 和蛋白水平表达变化。
结果 IUGR 大鼠出生时体质量、身长显著小于对照组(P 均<)。组织块培养
法培养骨骼肌细胞生长状态良好。与对照组相比,新生和 12 周龄 IUGR 组仔鼠中骨
骼肌细胞中,SOCS-1、SOCS-3 的 mRNA 和蛋白表达水平均增加(P 均<),而 IRS-1
的 mRNA 和蛋白表达水平均下降(P 均<),IRS-1mRNA 和蛋白表达水平均与
SOCS-1、SOCS-3mRNA 和蛋白表达水平呈负相关。
结论原代组织块翻转干涸培养法可简单有效的体外培养大鼠骨骼肌细胞,可
为后续研究稳定连续提供骨骼肌细胞。宫内发育迟缓大鼠子代骨骼肌细胞 SOCS-1、
SOCS-3 表达增加,通过负性调节使得 IRS-1 表达降低,可能是骨骼肌胰岛素抵抗和
成年代谢综合征发生的机制之一,提示 SOCS-1 和 SOCS-3 可以作为 2 型糖尿病和其
他胰岛素抵抗的治疗靶点。
关键词宫内发育迟缓;胰岛素受体底物-1;细胞信号转导抑制因子;胰岛素抵
抗
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第二部分细胞信号转导抑制因子特异性 shRNA 的构建及筛选
目的构建针对大鼠细胞信号转导抑制分子-1(SOCS-1)和-3(SOCS-3)基因的短发
夹 RNA(shRNA)表达载体,并选取最有效 shRNA 模板序列进行后续研究。
方法设计并合成编码的 shRNA 的两条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再
克隆至 pGPU6/GFP/Neo 中构建重组表达载体, 转化 DH5α菌株,进行序列测定,转
染至骨骼肌细胞中。Real- time PCR 和 Western blot 检测各组 SOCS-1 和 SOCS-3 的表
达情况。
结果测序证实重组质粒构建成功。四对 shRNA 模板序列对 SOCS-1 和 SOCS-3
的表达抑制与空白及阴性对照相比均有统计学意义(P<),且 Real-time PCR 和
Western blot 结果均一致的显示 SOCS-1-shRNAb 和 SOCS-3-shRNAa 分别干预效果最
佳。
结论 SOCS-1 和 SOCS-3 特异性 shRNA 重组表达载体构建成功,能有效抑制
大鼠骨骼肌肌细胞 SOCS-1 和 SOCS-3 的表达,为后续研究及代谢综合征的基因治疗
奠定了基础。
关键词细胞因子信号转导抑制因子;短发夹 RNA;RNA 干扰
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第三部分 SOCS-shRNA 对 IUGR 大鼠骨骼肌细胞葡萄糖摄取影响
目的探讨体外干预对宫内发育迟缓大鼠骨骼肌细胞在基础状态下及不同胰岛
素浓度刺激下的葡萄糖摄取的影响及机制。
方法采用母孕期饥饿法建立 IUGR 大鼠模型,组织块法原代培养大鼠骨骼肌细
胞,利用脂质体将 SOCS-1 和 SOCS-3 特异性 shRNA 重组质粒转染三月龄宫内发育迟
缓大鼠骨骼肌细胞,应用激光共聚焦法观察转染后骨骼肌细胞在基础状态下和不同胰
岛素浓度刺激下的葡萄糖摄取变化。通过 Western blot 检测骨骼肌细胞中葡萄糖转运
体 4(GLUT4)蛋白水平表达变化和细胞信号作用通路分子 Akt 的磷酸化水平。
结果 pGPU6/GFP/Neo-SOCS-1-shRNA、pGPU6/GFP/Neo-SOCS-3-shRNA 重组质
粒成功构建并转染 12 周龄宫内发育迟缓大鼠骨骼肌细胞及对照组后,细胞共聚焦显
微镜观察骨骼肌