文档介绍：基因工程综合实验操作

大肠杆菌常规培养
大肠杆菌在LB(Luria–Bertani)液体培养基中,37℃水浴摇床培养12-16小时。在LB固体培养基中,置于37℃培养箱培养12-16小时。如果培养用于提取具有氨苄青霉素(Amp)抗性基因质粒(如pUC18)的菌体,则需在培养基中加入100 mg/ml的氨苄青霉素。在重组子克隆的鉴定培养中,LB固体培养基中还要加入特定的生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷(X-gal),浓度为40 mg/ml,以及诱导物异基硫代-b-D-半乳糖苷(IPTG),浓度为50 mg/ml。
大肠杆菌染色体DNA的抽提
1. 大肠杆菌传一代后30ml液体LB培养基以10%接种量培养6小时,6000rpm,4℃,离心10分钟收获菌体沉淀。
2. ml Buffer A(含溶菌酶5 mg/ml),旋涡振荡混匀,37℃保温30分钟。
3. 加入400 ml 10% SDS使最终浓度为1%,混匀,37℃保温30分钟或澄清即可。
4. 加入10 ml 20 mg/ml的ProK至最终浓度为1 mg/ml,60℃保温60分钟。
5. 加入1 ml预先冷冻的5 mol/L NaCl至最终浓度为1 mol/L,充分混匀后冰浴30分钟。
6. 4℃,15 000 rpm,离心30min。
7. 取上清加入等体积(5 ml)的苯酚饱和溶液,充分混匀后4℃,15000 rpm,离心30分钟。
8. 取上清加入等体积的氯仿充分混匀后13000 rpm,4℃,离心10分钟。
9. V(4 ml)异丙醇充分混匀后-20℃放置30分钟以上,4℃,15000 rpm,离心30分钟。
10. 弃上清,沉淀用3ml 70%的冰乙醇洗涤,4℃,15000 rpm,离心5分钟。
11. 弃上清,沉淀于37℃凉干后,用1 ml ddH2O 溶解并移入Eppendorf管中。
12. 取5 ml电泳。
Buffer A Tris-HCl () 10 mM
EDTA () 20 mM

DNA酶切
在Eppendorf管中建立如下酶切反应体系:置于37℃,然后电泳检查
质粒DNA 5 ml
限制性内切酶 1 ml
10×酶切缓冲液 ml
无菌重蒸水 ml
总体积 15 ml

DNA琼脂糖凝胶电泳
1. 用1×TAE–%的琼脂糖凝胶,在微波炉中加热至琼脂糖溶解。
2. 待溶液冷却至60℃左右,加入溴化乙锭(用水配1 mg/ml贮存液) mg/ml,充分混匀。
3. 用透明胶封固玻璃板两头,- mm的位置上放置梳子,将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中,凝胶厚度
在3-5 mm之间。
4. 在凝胶完全凝固后,撕去透明胶,小心地将玻璃板移至装有1×TAE-buffer的电泳槽中,轻轻地拔去梳子,且使
缓冲液没过胶面约1 mm。
5. DNA样品与溴酚蓝混合后,用微量取样器慢慢将混合物加至样品槽中。
6. 盖上电泳槽并通电,使DNA向阳极(红线)移动。采用100V电压进行电泳。
7. 当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离后(约半小时),切断电流,取出玻璃板,在紫外灯下观查凝胶。
50×TAE-buffer
Tris 242 g/l
冰醋酸 ml/l
EDTA g/l

DIG分子杂交

1. 大肠杆菌染色体DNA(各1-2 mg)分别用BamHI、EcoRI、PstI、HindIII酶切,电泳。
2. 电泳拍照(胶边摆放尺以用于杂交阳性条带的定位),搭建转移台, NaOH的容器中依次摆放支架、玻板、普通滤纸、塑料薄膜(剪掉比凝胶尺寸略小一号的一块)、凝胶、尼龙薄膜和卷筒纸及500克重物,放置过夜。注:在摆放过程中要防止气泡的产生
3. 次日取出尼龙膜,在槽口处用圆珠笔标记后,在6×SSC中洗涤30s,放于牛皮纸上,于80℃烘2h,放入保鲜膜内于–20℃存放或立即杂交。
tailing
1. 用无菌水溶解oligonucleotide至适当浓度。
2. 在插入冰中的管中混合:
oligonucleotide 100pmol
反应缓冲液(vial 1) 4 ml
CoCl2溶液(vial 2) 4 ml
DIG-dUTP溶液(vial 3) 1 ml
dATP溶液(vial 4) 1 ml
TdT(50units)(vial 5) 1