文档介绍：实验八离子交换柱层析分离核苷酸
一、实验目的
本实验以酵母RNA为材料,将RNA用碱水解成单核苷酸,再用离子交换柱层析进行分离,最后采用紫外吸收法进行鉴定。同时通过测定各单核苷酸的含量,可以计算出酵母RNA的碱基组成。
本实验的目的是:
1. 了解掌握RNA碱水解的原理和方法
2. 掌握离子交换柱层析的分离原理和方法
3. 熟练掌握紫外吸收分析方法
二、实验原理
1. RNA的碱水解
实验室制备单核苷酸一般用化学水解法(酸、碱水解)和酶解法。RNA用酸水解可得到嘧啶核苷酸和嘌呤碱基;用碱水解可得到2'一核苷酸和3'一核苷酸的混合物;用5'一磷酸二酯酶或3'一磷酸二酯酶水解则分别可得到5'一核苷酸或3'一核苷酸。
RNA用碱水解,经过2'、3'一环核苷酸中间物,而后水解生成2'一核苷酸和3'一核苷酸。如下图所示。
,37℃保温18~20小时就能水解完全(也可以用1M KOH,80℃ KOH 100℃水解20min)。水解毕,用2M HClO4中和并逐滴调节至pH=2左右,生成的KClO4沉淀,离心去除之。上清液即为各单核苷酸的混合液。然后根据所选离子交换剂的类型,将上清液调至适当的pH值,作样品液备用。一般用阳离子交换剂,,用阴离子交换剂,pH调至8 ~ 9(逐滴)。此处用KOH是为了便于除去钾离子以降低样品溶液中的离子强度。
2. 单核苷酸的离子交换柱层析分离
离子交换层析是根据各种物质带电状态(或极性)的差别来进行分离的。电荷不同的物质对离子交换剂有不同的亲和力,因此,要成功地分离某种混合物,必须根据其所含物质的解离性质,带电状态选择适当类型的离子交换剂,并控制吸附和洗脱条件(主要是洗脱液的离子强度和pH值),使混合物中各组分按亲和力大小顺序依次从层析柱中洗脱下来。
在离子交换层析中,分配系数或平衡常数(Kd)是一个重要的参数:
Kd = Cs / Cm
式中:Cs是某物质在固定相(交换剂)上的摩尔浓度,Cm是该物质在流动相中的摩尔浓度。可以看出,与交换剂的亲和力越大,Cs越大,Kd值也越大。各种物质Kd值差异的大小决定了分离的效果。差异越大,分离效果越好。影响Kd值的因素很多,如被分离物带电荷多少,空间结构因素,离子交换剂的非极性亲和力大小,温度高低等。实验中必须反复摸索条件,才能得到最佳分离效果。
核苷酸分子中各基团的解离常数(pK)和等电点 p I 值见表1。
表 1 四种核苷酸的解离常数(pK)和等电点pI值
核苷酸
第一磷酸基
pKa1
第二磷酸基
pKa2
含氮环的亚氨基(-NH+ =)
pKa3
等电点
pI值*
尿苷酸UMP
鸟苷酸GMP
腺苷酸AMP
胞苷酸CMP
*注:pI = (pKa1 + pKa3) / 2
由表1可见,含氮环亚氨基的解离常数( pK )值相差较大,它在离子交换分离四种核苷酸中将起决定作用。
用离子