文档介绍：植物功能基因分离技术程序
植物基因分离的方法
目前植物基因分离的方法很多,但主要可以概括为四类:
基于蛋白质的基因分离:蛋白质——基因
基于mRNA产物的基因分离
基于基因同源序列的基因分离:同源克隆。
基于表型突变体的基因分离,目前最主要的基因分离方法。
1、基于蛋白质的基因分离
生物材料(不同处理、不同环境、不同发育时期)
1D或2D电泳
原位酶解
多肽分析(质谱分析)
蛋白数据库分析
多肽序列分析
多肽序列标签
表达序列标签分析
功能鉴定
2、基于RNA的基因分离
基于基因的RNA的表达特征已经发展了10多种植物基因的分离方法,如mRNA差异显示、代表性差异分析、减法杂交、抑制性减法杂交、基因表达连续分析法等约10多种。这些方法大同小异。这些方法大多依赖于PCR技术,因此重复性较差,假阳性率较高,对实验材料的对等性要求较高,目前已很少使用。
3、基于同源基因序列的基因分离
植物的种、属之间, , 就可以根据该基因的序列从另一种植物中分离这个基因.——同源克隆
PCR法, 如 RACE
探针法, 筛选核DNA文库或cDNA文库
正向遗传学
表型突变体
基因序列
功能
功能
基因序列
基因干涉
表型突变体
反向遗传学
4、基于表型突变体的基因分离
突变体是否为T-DNA插入突变体的遗传分析
显性早熟突变体
H
SGP
h
sgp
H
SGP
h
sgp
H
SGP
h
sgp
H
SGP
h
sgp
H
SGP
H
SGP
h
sgp
H
SGP
h
sgp
h
sgp
早熟抗潮霉素
早熟抗潮霉素
早熟抗潮霉素
早熟抗潮霉素
迟熟不抗潮霉素
3 早熟抗潮霉素:1迟熟不抗潮霉素
F1
F2
从F2群体中随机取100株早熟的植株叶片进行潮霉素抗性分析:
A、100株全抗
——基因H和SGP可能共分离或紧密连锁
——进一步分析更大群体(1000株以上,且包含早熟和迟熟个体),如果仍共分离
——可初步认为是T-DNA 插入突变体。
SGP为显性早熟基因
H 为潮霉素抗性基因
突变原因分析
H
SGP
h
sgp
H
SGP
h
sgp
H
SGP
h
sgp
H
SGP
h
sgp
H
SGP
H
SGP
h
sgp
H
SGP
h
sgp
h
sgp
早熟抗潮霉素
早熟抗潮霉素
早熟抗潮霉素
早熟抗潮霉素
迟熟不抗潮霉素
3 早熟抗潮霉素:1迟熟不抗潮霉素
F1
F2
B、不全抗
——不是T-DNA插入突变。
潮霉素抗感株数之比不符合3:1
——基因H和SGP可能连锁,
值得扩大群体进一步分析。
潮霉素抗感株数之比符合3:1
——基因H和SGP独立遗传。
SGP为显性早熟突变基因
H 为潮霉素抗性基因
h
SGP
突变原因分析
H
sgp
h
SGP
H
sgp
T-DNA插入突变体基因分离程序
侧翼序列扩增
候选基因的选择
候选基因表达分析
突变体的遗传互补分析
突变基因的确定