文档介绍：《生物技术大实验》讲义
实验一枯草芽孢杆菌对棉花黄萎病的拮抗作用
实验目的: 进一步掌握无菌操作技术,加深对微生物之间互作的进一步认识
实验原理: 枯草芽孢杆菌分泌到体外的带谢产物能够抑制棉花黄萎病的生长
供试菌株(1) 拮抗菌株: 枯草芽孢杆菌(冰箱保存)
(2) 病原菌株: 棉花黄萎病菌(冰箱保存)
实验步骤
1. 培养基的制作
PD培养液:(2) PDA培养基:查氏培养液:按上述配方配制查氏液体50 ml及固体胶培养基125 ml分别装在250的三角瓶中,121℃条件下灭菌30分钟。
2. 接种培养
(1) 在无菌操作条件下,将棉花黄萎病菌接种在查氏培养液中,28℃振荡培养4天。
(2) 将枯草芽孢杆菌在PD培养液中28℃培养24小时
3. 抑菌试验
(1) 平板制备:将固体PDA培养基溶化后倒入培养皿中,制成平板
(2) 棉花黄萎病菌液涂皿:将棉花黄萎病菌液用玻棒均匀的涂布在查氏平板培养基上
(3) 枯草芽孢菌的接种:将圆滤纸片放置在平板培养基上,用吸管吸取少许枯草芽孢杆菌菌悬液滴到滤纸片上
(4) 培养:28 ℃培养箱中培养4天
(5) 观察结果
实验二酶联免疫法测ABA含量
仪器: 酶联免疫仪
酶标板
752分光光度计
实验原理本方法是一种固相抗原型酶联免疫法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELISA),先将ABA蛋白质复合物与固相载体(聚苯乙烯微量滴定板)结合,然后将待测的ABA(样品或标准品)和兔抗ABA抗体加入微量滴定板的孔中,进行竞争反应,接着弃去上清液,洗涤固相表面,加入酶标二抗使其与结合在固相ABA上的抗体反应,最后去除多余的未反应的酶标二抗,测定与固相结合的酶活性,酶活性和待测ABA含量呈负函数关系,即固相ABA结合的抗体与酶标二抗量(OD或B%)随待测ABA含量增加而减少,以一系列已知浓度的ABA的OD值制图而获得标准竞争性抑制曲线,对于未知样品B,只要在同样条件下测定反应后的OD值,就可以从标准曲线上查到ABA的量。
测定方法
包被:在微量滴定板内准确加入100μLABA包被液,37℃湿盒过夜。
标样稀释?:取8支试管每管加150μLDB,第一管中加入50μL(2000ng/50μL)标准液,充分涡旋后,取50μL至第二号管中,同样涡旋后,取50μL到第三管;依次稀释到第六管,稀释后的标准ABA依次为1000ng、500ng、250ng、125ng、、、、。
洗板:从37℃湿盒中取出滴定板,恢复到室温后,弃去包被液,用WB(洗涤缓冲液)洗涤三次,甩干(吸水纸)。
加样:1~8孔对应加入ABA标样50μL,10号孔相应加入最浓ABA标样,9号孔加50μLDB,三排重复;然后每孔加50
μL抗体,37℃ 45分钟。
洗板:
加酶标二抗:每孔加100μL,37℃反应1小时。
洗板:
显色:各孔加10μLOPD显色液,37℃ 20分钟。
终止反应:各孔加50μL 6NH2SO4。
读数:490nm读取OD值。其中10号孔调零,而9号孔为最大值(B0),1~8号孔的OD值为B。
结果计算:以In(B/B0)∕(1-B/B0)为纵坐标,以标准AB