文档介绍：上海海洋大学
硕士学位论文
沙门氏菌逆转录PCR检测方法的研究
姓名:张弛
申请学位级别:硕士
专业:食品科学与工程
指导教师:包建强
20091201
沙门氏菌逆转录觳夥椒ǖ难芯摘要本研究采用逆转录聚合酶链式反应韵妇腞为食品安全关系国计民生,影响着人们的生活、工作与健康,越来越引起人们的关注。其中食源性致病菌是引起人类食源性疾病的主要病因之一,而沙门氏菌又是其中最常见的食源性致病菌,所引发的疾病占世界食源性疾病的第一位,同样也占我国内陆地区食物中毒的第一位。对于沙门氏菌的检测目前多以传统的培养检测方法及生化检测为主,血清型检测为辅,大多操作步骤繁琐,周期较长,对细菌的某些亚种及亚型也不能给出理想的鉴定结果,在实际运用中遇到越来越多的问题。近年来,分子生物学的发展及其与病原性细菌检测法相结合大大提高了检测的效率,缩短了检测流程,但这些方法多针对细菌的剑芩劳鱿妇辛鬌、同源性核酸片段及“活的不可培养状态微生物”的影响,无法区别死或活的细菌,常常造成测结果与常规方法相比,阳性率偏高的现象。检测靶标,利用胂妇婊钭刺笆康南喙匦裕⒘似胀逆转录觳夥椒ê褪凳庇ü饽孀B糚检测方法。同时,在样品制备时采用新型的、具有自主知识产权的磁性纳米粒子技术,用于沙门氏菌分离,提高制备的特异性,可有效提高检测上海海洋大学硕士学位论文
方法的灵敏度。其中,普通逆转录椒ㄕ攵陨趁攀暇B嫉钠鹗因子基因设计引物,以基因的为检测对象,能有效地将沙门氏菌与其他亲缘关系较近的肠杆菌科细菌区分开来。样品中沙门氏菌添加实验表明,该方法对沙门氏菌的检测下限,检测时间少于Sü舛磕孀B糚检测方法,针对沙门氏菌外膜蛋白基因进行检测,使用探针,能有效地将沙门氏菌与其他亲缘关系较近的肠杆菌科区分开来。该方法检测灵敏度达到隹奖矗觳庀孪/稍小时内得到检测结果。同时,我们将此方法与市售的沙门氏菌属荧光定量觳馐约梁邢啾冉希⑾指梅ň哂懈叩牧槊舳取O啾扔谄胀转录凳庇ü舛縋技术更具有灵敏度高、特异性好、无需从蟠聿街璧扔诺恪本研究所使用的磁性纳米粒子分离法,大大地缩短了检测时间,节省实验步骤,节约检测成本。该方法在诒憧墒迪种接从细胞或组织中高效地提取,从目标菌株中快速、有效地富集并提取与传统的崛》椒ㄏ啾龋梅ú恍璩樘嶙躌,也不需要使用宋北苊饬朔樱确鲁樘帷⒁掖汲恋怼高速离心等步骤,该法解决了目前制约食品中致病菌检测周期的前增菌时间过长问题,并且研究过程中采用进口磁珠试剂盒与本研究中使用的具有自主知识产权的磁珠试剂盒比较,两者分离效率一致。上海海洋大学硕士学位论文
本研究利用添加阳性菌株模拟了沙门氏菌污染食品的实验,通过贮存时间和温度的调节,测定菌株核酸的稳定性及检测效率。我们模拟了日常生活中食品的处理温度,如和℃。笆椅孪路胖弥、笥闷胀≧甈法进行检测。当沙门氏茵完全死亡时,ü夥觯胀≧甈法检测也未出现扩增条带。由此可以确定我们所设计的沙门氏菌的法能够很好的区别样品中死、活细菌对检测结果的影响,从而克服检测过程中存在的假阳性的情况。本研究所建立的逆转录觳夥椒ㄓ氪撤椒ㄏ啾龋蟠蟮厮短了检测时间,节省了检测步骤,具有快速、灵敏、敏感性高的优点,适宜于在食品卫生行业中进行推广及应用。关键词:沙门氏菌,磁性纳米粒子,逆转录聚合酶链式反应,实时荧光,致死实验上海海洋大学硕宦畚
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⋯⋯魍础指导教师签名:、副∥越岛学位论文作者签名:璇划学位论文作者签名:嗽秽上海海洋大学学位论文原创性声明上海海洋大学学位论文版权使用授权书本人郑重声明:我恪守学术道德,崇尚严谨学风。所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写,我对所写的内容负责,并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。日期:年日本学位论文属于保密,在年解密后适用本版权书。不保密学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。口■
第一章引言趁攀暇慕樯沙门氏菌属是一大群寄生于人类和动物肠道内的革兰氏阴性杆菌。年首先发现伤寒杆菌,年分离到猪霍乱杆菌,由于发现本属细菌的时间较早,在研究中的贡献较大,遂定名为沙门氏菌属。沙门氏菌是一