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分子克隆实验原理
一、菌种保存和活化
二、质粒提取和保存
三、感受态细胞的制备
四、载体的制备
五、基因的制备
六、连接
七、转化
八、重组克隆的筛选
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菌种保存和活化
：
1、 100 ul菌液＋100 ul灭菌甘油【混匀】
2、多制备几管，做上标记【菌名，质粒，时间】
3、－20 ℃可保存半年；【－80 ℃可长期保存】
二、甘油菌活化：
1、取一管甘油菌，混匀；
2、用接种针接种并在培养平板上划线；
3、37 ℃倒置培养12 h；
4、 LB (视情况加抗生素），37 ℃振荡培养12 h.
【注明：甘油菌用完后，最好扔掉，反复冻融易死亡。】
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质粒的提取原理－碱裂解法
三种溶液：
溶液1： 50 m mol/l 葡萄糖----------------维持渗透压，防止DNA受机械损伤降解；
25 m mol/l Tri· Cl （pH )---维持 pH;
10 m mol/l EDTA (pH )------螯合Ca2+, DNase 失活，保护DNA
溶液2： mol/ NaOH--------------------核酸变性（pH>12或pH<3) (解链）
1% SDS-----------------------------蛋白变性，裂解细胞。
溶液3： mol/L NH4AC （pH ) -------沉淀蛋白，大分子核酸，调节pH,使小分子核酸复性（可溶）。
其它溶液：
（1）2M NH4AC------------------------------沉淀蛋白，溶解核酸；
(2) 异丙醇-----------------------------沉淀质粒
（3）70％乙醇---------------------------沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。
(4) RNase--------------------------------除去细菌RNA
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质粒的提取原理－碱裂解法
Protocal:
ml 菌液， 12000 rpm * 1 min, 弃上清（repeat) －－收集细菌
溶液1 (200 ul), 剧烈混匀－－－－－－－－－－－－－提供缓冲液
溶液2 (400 ul)，温柔混匀，冰中5 min;－－－－－－－裂解细胞，蛋白核酸变性
溶液3 (300 ul), 温柔混匀，冰中10 min;－－－－－－－质粒复性
13000 rpm* 5 min, 取上清；－－－－－－－－－－－－除去细菌蛋白，基因DNA
540 ul 异丙醇，室温 10 min;－－－－－－－－－－－－沉淀质粒
14000 rpm * 10 min, 弃上清；－－－－－－－－－－－－除去可溶性杂质
100 ul 2M NH4AC
13000 rpm* 5 min, 取上清；
100 ul 异丙醇，室温10 min;
14000 rpm * 10 min, 弃上清；
70%乙醇500 ul, 14000 rpm * 10 min, 弃上清；－－－－－除去异丙醇，盐分
烘干10-30 min, －－－－－－－－－－－－－－－－－除去乙醇
50 ul ddH2O ( mg/ ml RNase), 37°C* 30 min.－－－－除去细菌RNA
电泳鉴定
初
抽
精
抽
除去少量杂质蛋白
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质粒的保存
(可含EDTA) 中可短期保存
[4 ℃保存1月; -20 ℃可保存一年]
2. 75%乙醇可长期保存.
3. 烘干可长期保存(可能难溶)
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感受态细胞的制备
1. 菌种活化
LB培养液中；
3、37 ℃ ，振荡培养2h至对数期；
4、转至50 ml无菌塑料管， 0 ℃ *10 min;
5、5000 rpm *10 min * 4 ℃
6、取沉淀，加25ml 50mM CaCl2【0 ℃，无菌】
7、 5000 rpm *10 min * 4 ℃
8、取沉淀, 加 2 ml 含15％甘油的50 mM CaCl2重悬，200 ul/tube分装，液氮速冻后至－80 ℃冰箱保存（半年有效）。
【注意：（1）需要做一个无质粒的对照