文档介绍：实时荧光定量PCR (real-time PCR)
分子生物学实验技术
赵燕燕
2007年5月22日
聚合酶链式反应( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后,我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析,也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析,分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下,我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。
实时定量PCR技术,是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,使每一个循环变得“可见”,最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA (or cDNA) 的起始浓度进行定量的方法。
实时荧光定量 PCR是目前确定样品中DNA (或 cDNA) 拷贝数最敏感、最准确的方法。
Real Time PCR and Conventional PCR
VS
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
3’
5’
5’
Taq
Taq
5’
3’
Repeat
Denaturation
Primer Annealing
Elongation
常规 PCR Process
In theory, product accumulation is proportional to 2n,
where n is the number of amplification cycle repeats
Reality vs. Theory
Amplification is exponential, but the exponential increase is limited:
A linear increase follows exponential
Eventually plateaus
Theoretical
Real Life
Log Target DNA
常规PCR方法的局限性分析:
无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析
必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而且EB有毒
无法对扩增反应实时检测
定量的最佳时期
Quantitative es from monitoring
the early stages of amplification.
Real Life
Detector
Theoretical
Log Target DNA
Cycle #
荧光定量PCR和常规PCR技术的区别
常规PCR是通过电泳对扩增反应的最终产物进行定性分析(定量不准确);
荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,使每一个循环变得“可见”,通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA (or cDNA) 的起始浓度进行定量的方法(准确定量) 。
荧光定量PCR的原理
荧光定量PCR检测时,在普通PCR的基础上加入的荧光化合物可分为非特异性的嵌入荧光染料及特异性荧光(引物)探针两大类型。前者是利用嵌入荧光染料检测,只是简单地反映PCR反应体系中总的核酸量,是一种非特异性的检测方法。后者由于增加了探针的识别步骤,特异性、专一性更高。二者各有优缺点,在不同的研究目的中被应用。
它们的基本原理是:扩增呈指数增长,在反应体系和条件完全一致的情况下,样本DNA含量与扩增产物的对数成正比,由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物(荧光探针)与扩增产物结合发光,其荧光量与扩增产物量成正比,因此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。